李想,田步先,閔連秋

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 錦州 121001)

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維生素D通過調(diào)節(jié)NF-κB活性對局灶性腦缺血大鼠的保護作用研究

李想,田步先,閔連秋

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 錦州 121001)

目的 探討維生素D(VD)通過調(diào)控NF-κB活性對局灶性腦缺血大鼠的保護作用。方法 72只SD大鼠隨機均分為假手術(shù)組、對照組、VD缺乏組和VD治療組，每組18只。假手術(shù)組及對照組均給予正常飼料喂養(yǎng)。VD缺乏組給予維生素D缺乏飼料喂養(yǎng)。VD治療組給予補充維生素D飼料喂養(yǎng)。共喂養(yǎng)10周。除假手術(shù)組外，其余各組均建立局灶性腦缺血模型。對各組大鼠進行神經(jīng)行為學(xué)評分。HE染色觀察梗死中心區(qū)及海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞數(shù)目及形態(tài)。免疫組化檢測細胞凋亡。電泳及免疫印跡觀察NF-κB蛋白的表達。結(jié)果 與假手術(shù)組相比較，對照組、VD缺乏組及VD治療組的海馬CA1區(qū)NF-κB p65活性明顯升高(P<0.01)；與對照組相比，維生素D缺乏組NF-κB p65表達明顯增強(P<0.01)，維生素D治療組NF-κB p65表達減弱(P<0.01)。結(jié)論 維生素D對大鼠局灶性腦缺血損傷具有保護作用，其機制可能是通過抑制NF-κB活化發(fā)揮抗炎作用而實現(xiàn)的。

維生素D；腦缺血；NF-κB

近年來，隨著腦卒中疾病發(fā)病率逐年升高，發(fā)病年齡逐年下降，人們對腦卒中防治的研究逐步深入。有文獻報道，缺血性腦卒中患者約占腦卒中患者總數(shù)的80%。尋找到行之有效的減少或減慢腦缺血形成的措施，對于腦缺血的防治具有十分重要的臨床應(yīng)用意義。NF-κB是一種普遍存在的細胞轉(zhuǎn)錄因子，是由NF-κB/Rel蛋白家族成員組成的同源或異源二聚體。Nurmi等[1]研究證實，腦缺血發(fā)生后，NF-κB可被激活，促進炎癥的發(fā)生、誘導(dǎo)細胞調(diào)亡、介導(dǎo)自由基的損傷，進而加重腦缺血損傷。

維生素D是一種具有生物活性的脂溶性類固醇衍生物，包括維生素D2(麥角骨化醇)及維生素D3(膽骨化醇)2者。其中在人類和動物體內(nèi)發(fā)揮主要生物作用的是維生素D3。此次研究應(yīng)用于治療組中的骨化三醇即為有活性的維生素D3。維生素D不僅在多種生理學(xué)過程起到關(guān)鍵的中介作用，而且對多種慢性疾病的發(fā)生發(fā)展起到調(diào)節(jié)作用[2]。近年來已有流行病學(xué)及臨床研究證實，人體內(nèi)維生素D水平與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)[3-4]。維生素D缺乏，可導(dǎo)致包括動脈粥樣硬化在內(nèi)的心血管疾病風(fēng)險增加[5]。最新研究證實，維生素D缺乏可能對心腦血管的功能產(chǎn)生不利影響，但并沒有結(jié)論性的研究支持這一觀點，心腦血管疾病的發(fā)生與維生素D含量關(guān)系的研究仍處于探索階段[6]。因此，本研究擬通過建立大鼠大腦中動脈局灶性腦缺血模型，探討維生素D能否通過調(diào)節(jié)NF-κB活性對局灶性腦缺血大鼠發(fā)揮腦保護作用。

1 材料與方法

1.1 動物及主要試劑 采用健康成年SD雄性大鼠72只，體質(zhì)量250～280 g，由遼寧醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK(遼)2003-0007。骨化三醇由上海羅氏制藥有限公司提供。NF-κB P65兔抗大鼠抗體及免疫組化染色試劑盒由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供。蛋白定量試紙盒等免疫印跡試驗試劑購于上海銳賽生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及給藥：72只實驗大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將其隨機分成4組：假手術(shù)組、對照組、VD缺乏組和VD治療組，每組18只。VD治療組除給予正常鼠糧外，每天給予骨化三醇 0.3 μg/(kg·d)溶于丙二醇溶媒[7]灌胃。VD缺乏組給予維生素D缺乏飼料(包括：玉米面76%，小麥麩20%，碳酸鈣3%，碘化鹽1%，賴氨酸0.5%)，確保其中維生素D不超過20 IU/kg，并每天給予等劑量的蒸餾水灌胃。假手術(shù)組及對照組給予正常鼠糧及等劑量蒸餾水灌胃飼養(yǎng)。采用清潔飲用水，無紫外光的白熾燈光照，光暗周期12 h:12 h，飼養(yǎng)環(huán)境清潔。飼養(yǎng)10周。末次給藥后30 min建立腦缺血模型。

1.2.2 局灶性腦缺血模型的建立：在Longa[8]提出大腦中脈閉塞(MCAO)模型基礎(chǔ)上，采用其改進方案[9]制備大鼠局灶性腦缺血模型。實驗大鼠末次給藥30 min后，腹腔注射10%水合氯醛350 mL/kg麻醉。大鼠取仰臥位固定，行頸正中切口，依次鈍性分離左側(cè)頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)、頸內(nèi)動脈(ICA)。結(jié)扎左側(cè)CCA近心端和ECA分叉部，動脈夾暫時夾閉ICA遠心端。在距CCA分叉處近心端約5 mm處剪口。選用頭端燒成光滑杵狀的國產(chǎn)尼龍線(直徑0.235 mm，長6 cm)插入，系牢栓線。松開動脈夾。線栓進入深度以頸總動脈分叉處計算為(18.0±0.5)mm，此時輕推尼龍線有阻力感，即已到達大腦中動脈起始部，實現(xiàn)了對左側(cè)大腦中動脈血流的阻斷。假手術(shù)組僅不插入線栓，余手術(shù)步驟同前。

參考Zea Longa法[10]對術(shù)后大鼠進行神經(jīng)功能缺失評分。評分于大鼠清醒后的24 h內(nèi)進行3次，最終取其平均值。

建模成功判斷標準[10]：①大鼠出現(xiàn)同側(cè)Horner征；②神經(jīng)功能缺失評分為1～3分者。剔除建模未成功的實驗大鼠，并于后續(xù)實驗中補充合格大鼠，以保證每組實驗用鼠數(shù)目。

1.2.3 腦組織病理學(xué)標本制備：分別在4個實驗組中，隨機各取出9只大鼠。于建模成功24 h后，以10%水合氯醛350 mL/kg進行腹腔麻醉。經(jīng)對側(cè)頸總動脈，先輸注冰生理鹽水50 mL及4%多聚甲醛50 mL，進行灌流內(nèi)固定。立即斷頭取腦，并將腦組織在4%多聚甲醛中繼續(xù)固定24 h。制備冠狀腦片，選擇梗死中心進行常規(guī)酒精脫水及石蠟包埋。制成4～6 μm厚的切片，行蘇木素-伊紅(HE)染色。觀察梗死中心區(qū)及海馬CAl區(qū)存活的神經(jīng)細胞數(shù)目。

1.2.4 免疫組化測定NF-κB陽性細胞數(shù)：石蠟切片經(jīng)脫蠟至水及微波修復(fù)抗原。兔抗鼠NF-κB抗體，在4 ℃下孵育24 h。嚴格遵照SP法免疫組化試劑盒要求進行操作，DAB顯色。以正常兔血清代替一抗作為陰性對照。光鏡下觀察大腦海馬CA1區(qū)NF-κB陽性表達細胞，染色陽性反應(yīng)物為棕黃色顆粒。每只大鼠取1張相同部位缺血側(cè)大腦海馬CA1區(qū)切片進行觀察。計算10個有代表性的高倍視野下陽性細胞數(shù)目。CIAS-1000型圖像分析儀計算NF-κB的陽性細胞數(shù)，并取平均值。

1.2.5 Western blot檢測大鼠海馬CA1區(qū)NF-κB蛋白的表達：取每組剩余的9只已成功建模的大鼠，斷頭取腦。將腦組織5 mg加入100 uL裂解液中，剪碎并機械勻漿。以4 ℃、17000 r/min離心20 min，取上清液，棄沉淀。用BCA法進行蛋白定量。取50 μg蛋白上樣進行12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。濕轉(zhuǎn)法將電泳后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉，抗體孵育。洗膜后進行增強化學(xué)發(fā)光顯色。以凝膠成像分析系統(tǒng)攝像分析測定目標帶的密度值(density value，DV)，計算出各組目標帶與β-actin DV比值。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分比較 造模成功后對各組大鼠進行評分：假手術(shù)組大鼠無明顯神經(jīng)功能缺損，其余3組均有不同程度的神經(jīng)功能缺損，其中以VD缺乏組神經(jīng)功能缺損最嚴重，評分最高；VD治療組神經(jīng)功能缺損較對照組明顯減輕，評分低于對照組(P<0.01)。見表1。

表1 VD對局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)行為學(xué)影響±s)

**P<0.01與 假手術(shù)組相比，compared with sham-operative group；##P<0.01，與對照組相比, compared with control group；△△P<0.01，與VD缺乏組相比，compared with VD-deficient group

2.2 各組大鼠腦組織的病理學(xué)特征 光學(xué)顯微鏡下觀察HE染色切片，假手術(shù)組僅可見正常神經(jīng)元細胞形態(tài)，其余3組均可見正常及不同損傷程度神經(jīng)元細胞混雜出現(xiàn)。正常神經(jīng)元，核圓形，邊界及核仁清楚。損傷神經(jīng)元，胞核腫大，偏位，核仁消失，胞漿著色淺、蒼白或核濃縮、深染，細胞呈三角形缺血性壞死變化。4組中，對照組及VD缺乏組損傷神經(jīng)元顯著增多，且以VD缺乏組的損傷神經(jīng)元特點表現(xiàn)的最為明顯；VD治療組中，維生素D能夠一定程度上改善神經(jīng)細胞的核深染、核固縮程度，減少細胞及間質(zhì)的水腫，使胞膜清楚、形態(tài)正常、核仁清晰可見的神經(jīng)細胞數(shù)目增多。見圖1。

圖1 大鼠腦組織HE染色Fig.1 HE staining results of rat brain tissue

2.3 各組大鼠腦組織切片免疫組化染色結(jié)果比較 腦組織切片中如NF-κB p65蛋白陽性表達，則胞漿或胞核中會顯示明顯棕褐色顆粒。在假手術(shù)組中，陽性表達不明顯，僅在海馬皮質(zhì)神經(jīng)元內(nèi)偶見；對照組中，陽性表達細胞數(shù)目較假手術(shù)組上升，且有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；VD缺乏組中，陽性表達細胞數(shù)目明顯高于其他各組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，圖像顯示在皮層、海馬區(qū)神經(jīng)元胞內(nèi)均可見大量棕褐色顆粒，其中部分細胞核和細胞質(zhì)可見陽性反應(yīng)物；VD治療組中，陽性表達細胞數(shù)目低于對照組和VD缺乏組，但高于假手術(shù)組(P<0.01)。見圖2、表2。

圖2 各組大鼠CA1區(qū)NF-κB p65蛋白表達的免疫組化染色結(jié)果(×400) Fig.2 Immunohistochemical staining results of NF-κB p65 protein expression in CA1 region of each group(×400)

組別例數(shù)NF-κBp65蛋白(/HPF)假手術(shù)組910.11±1.05對照組951.22±3.23**VD缺乏組972.22±4.66**##VD治療組923.56±3.64**##△△

**P<0.01與假手術(shù)組相比，compared with sham-operative group；##P<0.01，與對照組相比, compared with control group；△△P<0.01，與VD缺乏組相比，compared with VD-deficient group

2.4 Western-blot法檢測NF-κB蛋白表達水平 與假手術(shù)組相比較，對照組、VD缺乏組及VD治療組NF-κB蛋白表達明顯升高(P<0.01)。與對照組相比，VD缺乏組NF-κB蛋白表達明顯升高(P<0.01)，VD治療組NF-κB蛋白表達降低(P<0.01)。見圖3、表3。

圖3 VD對大鼠腦缺血后海馬CA1區(qū)NF-кB表達的影響Fig.3 Effect of VD on NF-κB p65 protein expression in CA1 region of focal cerebral ischemia rats

組別例數(shù)NF-κBp65蛋白(/HPF)假手術(shù)組9132.56±7.33對照組9433.89±10.07**VD缺乏組9504.67±11.07**##VD治療組9382.00±9.14**##△△

**P<0.01與 假手術(shù)組相比，compared with sham-operative group；##P<0.01，與對照組相比, compared with control group；△△P<0.01，與VD缺乏組相比，compared with VD-deficient group

3 討論

維生素D作為一種脂溶性維生素，不僅可以調(diào)節(jié)鈣磷代謝，還可以通過對細胞增殖、分化的調(diào)節(jié)，以及維持腦部細胞的發(fā)育及功能，進而參與腦血管病的病理生理過程。在哥本哈根城市心臟研究中，經(jīng)過歷時30年的隨訪觀察，最終于2013年發(fā)表的研究結(jié)果表明：隨著血清中維生素D3濃度的減少，缺血性癥狀性腦卒中風(fēng)險逐步增加。血清維生素D3水平最低的5%的個體較平均水平之上的個體發(fā)生缺血性腦卒中的風(fēng)險高出82%[11]；而血清中維生素D3濃度與出血性腦卒的發(fā)病率并無明顯相關(guān)性。類似的結(jié)論在Gotaro Kojima等[12]的夏威夷心臟研究項目中也有相似的發(fā)現(xiàn)。研究證實，低水平的維生素D3是致死性腦卒中的獨立預(yù)測因素[13]。本實驗發(fā)現(xiàn)，維生素D缺乏組大鼠局灶性腦缺血后，神經(jīng)功能評分明顯高于其他組別，且HE染色腦片中可見明顯核濃縮、深染，并出現(xiàn)較多三角形缺血性壞死細胞，表明維生素D的缺乏與腦缺血的發(fā)生有可能存在相關(guān)性。而接受維生素D治療的大鼠，神經(jīng)功能行為學(xué)評分要優(yōu)于對照組，且HE染色中神經(jīng)細胞核深染、核固縮的程度明顯改善，細胞及間質(zhì)的水腫較對照組有所減輕，部分細胞可見胞膜或核仁清晰、形態(tài)正常，表明維生素D的干預(yù)可減輕或預(yù)防腦缺血的癥狀或發(fā)生，進而證實了維生素D對缺血性腦卒中的保護作用。

NF-κB幾乎存在于所有細胞中，是一種普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子。主要是多肽p50及p65亞基形成的同源及異源二聚體，其中p65亞基具有轉(zhuǎn)錄激活功能，在細胞轉(zhuǎn)化、調(diào)控細胞增殖及凋亡過程中發(fā)揮重要作用。在神經(jīng)系統(tǒng)中，NF-κB主要存在于腦血管內(nèi)皮細胞、神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細胞中。有研究顯示，NF-κB是血管內(nèi)皮受損的始動機制之一。Clemens實驗證實，腦缺血發(fā)生后，在腦梗死病灶及周圍，不僅處于靜息狀態(tài)下的NF-κB被激活，而且也增強了NF-κB在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平上的表達[14]。腦缺血時，炎癥細胞因子高表達，活化的NF-κB誘導(dǎo)細胞因子、黏附因子、炎性酶類的表達[15]、氧自由基形成及鈣超載，引起炎癥級聯(lián)反應(yīng)，進而加重腦損傷。

Giarratana等[16]應(yīng)用胰島細胞進行實驗，發(fā)現(xiàn)維生素D類似物能夠通過下調(diào)IκBα的轉(zhuǎn)錄及NF-κB P65核移位，進而顯著下調(diào)促炎趨化因子的生成，抑制炎癥反應(yīng)。本研究也發(fā)現(xiàn)，通過免疫組化及Western blot，假手術(shù)組NF-κB p65陽性表達不明顯，而對照組、VD缺乏組及VD治療組均有不同程度的陽性表達，支持目前已有研究結(jié)論，即腦缺血時NF-κB被激活。與對照組相比較，維生素D缺乏組NF-κB p65陽性表達細胞數(shù)目明顯升高，而維生素D治療組陽性表達細胞數(shù)目較對照組有所下降，證實缺乏維生素D時，可加重NF-κB的激活，進而加重腦缺血損傷；而接受維生素D干預(yù)的大鼠，NF-κB激活數(shù)目有所減少，提示維生素D可抑制NF-κB被激活，抑制炎癥反應(yīng)過程，進而通過對NF-κB通路的阻礙對腦缺血大鼠起到保護作用。

隨著對維生素D作用機制的深入研究，有望為缺血性腦損傷的治療開辟新的途徑，為其防治缺血性腦血管病提供理論依據(jù)。

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(編校：吳茜)

Protective effect of Vitamin D on focal cerebral ischemia rats by regulating the activity of NF-κB

LI Xiang,TIAN Bu-xian,MIN Lian-qiu

(Department of Neurology, The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical College, Jinzhou 121001, China)

ObjectiveTo investigate the protective effect of vitamin D on focal cerebral ischemia rats by regulating the activity of NF-κB.Methods72 male SD rats were randomly divided into sham-operative group, control group, VD-deficient group and VD-sufficient group,each had 18 rats.Rats in sham-operative group and control group received normal diet.Rats in VD-deficient group received VD-deficient diet.Rats in VD-sufficient group received VD-sufficient diet.The MCAO model was made after each group pretreated for 10 weeks.Surgical procedures of sham-operative group was the same as the above, but no thread inserted.Neuroethology evaluations for each group of rats and the cerebral pathological conformation were observed by HE staining.The expressions of nuclear factor-kappa B(NF-кB)detected by immunohistochemical and Western blot.ResultsThe neurological severity score in VD-sufficient group was lower than that in control group(P<0.01); the expression of NF-кB in VD-deficient group was highest than others (P<0.01), and the expression of NF-кB in VD-sufficient group was lower than that in control group (P<0.01). ConclusionVD has the protective effect on focal cerebral ischemia rats, and the mechanism may be related with the decreasing of NF-кB expression.

vitamin D; cerebral ischemia; NF-κB

遼寧省自然科學(xué)基金(20092192)；遼寧省科學(xué)計劃項目(2012225019)

李想，女，在讀碩士，研究方向：腦缺血的基礎(chǔ)研究，E-mail：mia.1988@live.cn；閔連秋，通訊作者，女，碩士，教授、主任醫(yī)師，研究方向：腦血管疾病，E-mail：minlianqiu@163.com。

R743.31

A

1005-1678(2015)01-0006-04