徐婷,褚江洪,丁萍英,倪連松

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬臺州醫(yī)院 內(nèi)分泌科，浙江 臨海 317000)

?

葛根素對α-葡萄糖苷酶抑制作用機理的探討

徐婷,褚江洪,丁萍英,倪連松Δ

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬臺州醫(yī)院 內(nèi)分泌科，浙江 臨海 317000)

目的 探討葛根素對α-葡萄糖苷酶的抑制作用機理。方法 取40只雄性小鼠，分為5組：對照組、阿卡波糖對照組、葛根素(2.5、5.0、10)μM，每組8只，采用酶抑制動力學(xué)方法，研究葛根素對α-葡萄糖苷酶的抑制作用和抑制動力學(xué)，并用分光光度計測定葛根素對小鼠血糖含量變化的影響。結(jié)果 葛根素是一種可逆的競爭型α-葡萄糖苷酶抑制劑 [半抑制濃度IC50為(4.32±0.42)μM]，抑制常數(shù)Ki為(0.41± 0.09)μM；與陽性對照阿卡波糖對比，葛根素能夠明顯的抑制大鼠血糖水平的增長。結(jié)論 葛根素作為一個α-葡萄糖苷酶抑制劑，誘導(dǎo)了酶活性的降低，對調(diào)節(jié)血糖水平起到重要作用，為臨床降血糖提供了理論基礎(chǔ)。

葛根素；α-葡萄糖苷酶；抑制作用；血糖水平；糖尿病

糖尿病類型主要有兩種：1型糖尿病和2型糖尿病，它們所引起癥狀幾乎是相同的[1]，但是所引起疾病的病理卻是有所差別的[2]。α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)種類繁多，性質(zhì)各異，廣泛的分布在生物體內(nèi)，它可以從低聚糖類的非還原末端切開α-1,4糖苷鍵，釋放出葡萄糖[3]，在人類的正常糖類代謝和機體功能方面起到了重要的生理作用，但是當(dāng)人體內(nèi)血糖過高時，可以通過抑制α-glucosidase的活性來降低血糖的含量[4]，起到治療糖尿病及其并發(fā)癥的效果，因此，在醫(yī)藥行業(yè)中α-glucosidase抑制劑被廣泛用于預(yù)防和治療糖尿病、高血脂等疾?。?/p>

葛根素(puerarin)亦稱葛根黃素，是從中藥葛根中分離的具有擴冠作用的異黃酮類衍生物，存在于豆科植物葛及野葛的根，具有退熱、鎮(zhèn)靜和使冠狀動脈血流量增加的作用。有大量文獻表明，葛根素具有降低血糖的作用，但其作用機制以及活性組分的詳情尚不清楚。本課題葛根素為抑制劑，通過體外酶抑制實驗并系統(tǒng)深入研究了其對α-glucosidase的相關(guān)抑制動力學(xué)，并通過對灌胃的小鼠血糖值的抑制作用研究，最終獲取葛根素對α-glucosidase的抑制機理，以期為其在降血糖醫(yī)藥領(lǐng)域的更有效應(yīng)用提供有益的參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 將禁食16 h的雄性小鼠40只(上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供，許可證號:SGXK(滬)2013-0010)，分為5組，每組8只，(第一組為對照組，第二組為阿卡波糖對照組，第3組～第5組為葛根素的3個濃度組)。

1.2 儀器與試劑 UV-2450紫外、可見分光光度計(日本島津公司)；pHs-3C型酸度計(上海雷磁儀器廠)；Millipore Simplicity水純化系統(tǒng)(法國密理博公司)；血糖測定試劑盒(蘭州生物化學(xué)試劑公司)。

α-葡萄糖苷酶從面包酵母中得到(上海TCI公司)，其標(biāo)準(zhǔn)溶液用pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液進行配制；對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)、阿卡波糖(Sigma公司)標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液用pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液進行配制；葛根素(阿拉丁試劑有限公司)；其他試劑均為分析純，實驗用水為超純水。

1.3 實驗方法

1.3.1 葛根素對α-glucosidase的抑制作用：α-glucosidase活性的測定參考Ohta[5]的方法，α-glucosidase催化pNPG產(chǎn)生對硝基苯酚(在處有特征吸收峰)，因此本研究利用UV-2450紫外分光光度計的動力學(xué)/時間軟件測定在405 nm處的紫外吸收(酶催化pNPG生成對硝基苯酚)，在37 ℃下，pH 7.0的磷酸鹽(0.5 mM)緩沖體系中，α-glucosidase(1.0 μM)和不同濃度的葛根素孵化3 h，加pNPG(0.5 mM)后，每隔30 s在405 nm處測定吸光值的變化，并通過下列關(guān)系式對α-glucosidase活性進行評估活性抑制測定重復(fù)3次。抑制率(%)=[ΔAbs540(空白)-ΔAbs540(樣品)/ΔAbs540(空白)]×100%。

1.3.2 葛根素對α-glucosidase的抑制動力學(xué)研究：在上述實驗條件下，固定α-glucosidase的濃度，測定不同葛根素濃度條件下，底物濃度對α-glucosidase催化速率的影響，根據(jù)Lineweaver Burk雙倒數(shù)圖，計算并評估葛根素對α-glucosidase的抑制作用類型，最終求出抑制常數(shù)Ki抑制動力學(xué)實驗重復(fù)3次。

1.3.3 葛根素對小鼠血糖含量的影響：對照組：用灌胃器吸取0.1～0.2 mL suerose (2 g/kg)溶液灌入第一組小鼠的胃中，15 min后再灌入同樣體積的雙重蒸餾水，之后從灌入雙重蒸餾水以后開始計時，分別在30，60，120 min時以斷尾取血的方法對小鼠的血糖值進行測定。第2組～第5組將對照組中的雙重蒸餾水分別替換為阿卡波糖(10 μM)，葛根素(2.5, 5.0, 10 μM)，其他組份不變。測定血糖時，將每組每只小鼠不同的時間點都需進行編號，并將血液收集在離心管中，然后進行離心3000 r/min，時間為15～20 min左右，最后收集管中上層的血清，用分光光度計進行比色測定血糖含量測定重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 葛根素對α-glucosidase的抑制活性 圖1為葛根素的分子結(jié)構(gòu)式。圖2顯示，隨著葛根素濃度的增加(0～20 μM)，抑制率在不斷升高，隨著葛根素的濃度達繼續(xù)增加，對α-glucosidase的抑制能力的趨于平緩，解析其半數(shù)抑制濃度(IC50)為(4.32±0.42)μM，與陽性對照阿卡波糖(IC50)為(18.12±1.15)μM相比，葛根素對α-glucosidase的半抑制濃度低于陽性對照阿卡波糖，表現(xiàn)出了良好的α-glucosidase抑制活性。

圖1 葛根素的分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of puerarin

圖2 葛根素抑制α-葡萄糖苷酶的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of puerarin on α-glucosidase

2.2 葛根素對α-glucosidase抑制動力學(xué)研究 通過Lineweaver-Burk雙倒數(shù)方程作圖，求得和比較酶催化反應(yīng)的動力學(xué)參數(shù)表觀米氏常數(shù)(Kmapp)和最大反應(yīng)速率(Vmax)，Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖 (圖3)是相交于縱坐標(biāo)的一組直線，這表明體系中Vmax保持不變，而Kmapp逐漸增大，這是典型的競爭性抑制作用類型[6]。這表明葛根素可能會結(jié)合到α-glucosidase的活性中心區(qū)域并與周圍的氨基酸殘基發(fā)生相互作用，一方面會與底物競爭活性位點，另一面會誘導(dǎo)酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化是酶自身的催化活性降低。在此基礎(chǔ)上，通過二級曲線方程，求得抑制常數(shù)Ki=(0.41± 0.09)μM。

圖3 葛根素抑制α-葡萄糖苷酶的Lineweaver-Burk曲線Fig.3 Lineweaver-Burk plot for inhibition of puerarin on α-glucosidasec(葛根素)/(μM), 從下向上：0, 2.5, 5.0, 10.(n=3).

圖4 葛根素對血糖水平增長的抑制作用Fig.4 The inhibition of puerarin on the increase of blood glucose levels

2.3 葛根素對小鼠血糖含量的影響 結(jié)果顯示，用蔗糖灌胃后的小鼠再用葛根素灌胃，由圖4可以看出，葛根素對抑制血糖值的升高方面有顯著的劑量依賴性，在對照組中，當(dāng)加入蔗糖后，血糖值由74.66 mg/dL升高到179.54 mg/dL，而隨后又降了下來，在葛根素和陽性對照這四組中，在給藥后30 min，小鼠的血糖值與對照組相比都出現(xiàn)了明顯的降低，葛根素(5 μM)與阿卡波糖(10 μM)表現(xiàn)出了相當(dāng)抑制作用。

3 討論

體內(nèi)胰島素分泌不足所導(dǎo)致的一系列臨床綜合癥稱之為糖尿病，這是一種與遺傳基因有著非常密切的疾病。多飲、多尿、多食和體重下降(三多一少)為糖尿病的主要臨床表現(xiàn)，此外其病理檢測手段主要是依據(jù)血糖高、尿液中含有葡萄糖等現(xiàn)象，而糖尿病所引起的并發(fā)癥[7-9]給人們的生理和心理上都造成了巨大的傷害，故安全，有效的降血糖藥物的開發(fā)越來越受到專家和學(xué)者的重視。糖尿病的的主要類型分為:1型和2型兩種，1型糖尿病始于體內(nèi)胰腺中胰島β-細胞產(chǎn)生了應(yīng)激反應(yīng)，黃酮類物質(zhì)能改善這類糖尿病的病癥，此外，黃酮類物質(zhì)還能通過許多途徑激發(fā)出弱的胰島素效應(yīng)，比如影響磷酸蛋白激酶，α-glucosidase來降低血糖的活性。本研究可以初步推測：在降血糖方面，黃酮發(fā)揮了主要作用，在8種黃酮中，7種黃酮具有α-glucosidase抑制活性。

目前，Acarbose是常用于臨床輔助治療的α-glucosidase抑制劑，但是它會對人體產(chǎn)生很強的毒副作用[1]，故不能被全部人群所接受，而新的化學(xué)合成藥物需要的步驟較繁瑣、毒性大和效率低等弊端顯著，這就使得開發(fā)出具有低毒性、來源于藥用植物的新型α-glucosidase抑制劑迫在眉睫，而且這也是迫切需要和亟需解決的問題。多種中草藥的提取液中進行α-glucosidase活性的抑制實驗結(jié)果表明，五味子、桑葉、大黃、虎杖等[10-11]對α-glucosidase具有良好的抑制效果；食品中含有很多功能性因子具有降血糖的功能，研究發(fā)現(xiàn)，豆制品包括豆鼓和腐乳等對α-glucosidase有較強的抑制活性[12]，這可能是由于豆制品自身的降血糖功能因子和微生物發(fā)酵物[13]共同對α-glucosidase抑制的結(jié)果。Kwon等[14]研究了8種茄子提取物對α-glucosidase活性的抑制作用，研究發(fā)現(xiàn)，茄子中酚類分子的含量會直接影響到α-glucosidase活性的抑制大小。此外，烏龍茶、沙丁魚活性多肽以及食品添加劑D-木糖都對α-glucosidase具有良好的抑制作用。在本試驗中發(fā)現(xiàn)，葛根素表現(xiàn)出了良好的α-glucosidase抑制效果，且這種抑制作用具有濃度依賴性，隨后的動物實驗發(fā)現(xiàn)，葛根素能夠顯著的降低飯后小鼠的血糖，這很可能是由于黃酮類化合物的構(gòu)效效應(yīng)引起的；此外葛根素具有多種藥理活性，且其低毒性的特點對引起人體的的副作用的概率大大降低，很值得臨床推廣。

國內(nèi)外研究表明[15-16]，抑制劑對相關(guān)疾病有關(guān)的酶的抑制作用呈現(xiàn)可逆的競爭性作用時，這時可以根據(jù)酶活性的高低，通過有效的控制抑制劑藥物的劑量，來高選擇性、可逆的降低酶的活性，而不是使酶徹底的失活，而引起其他不良反應(yīng)，在我們的研究中發(fā)現(xiàn)葛根素是典型的競爭性抑制劑，這表明葛根素會以非共價力，高選擇性的結(jié)合到α-glucosidase的活性中心，可逆與底物競爭活性位點，從而達到抑制的效果；除上述所列出的α-glucosidase抑制劑類型外，還有包括動物和微生物來源的抑制劑等。雖然現(xiàn)在很多合成藥物在臨床糖尿病的治療中起到了很好的治療效果，但是對人體的毒副作用也是不可小視的。例如，此類藥物服用一段時間后會出現(xiàn)腸鳴音亢進的反應(yīng)，還會出現(xiàn)腹痛、腹脹、排氣增多等胃腸功能的紊亂和皮膚反應(yīng)[17]。因此天然植物來源的抑制劑越來越來成為降血糖藥物開發(fā)的重點，然而植物成分的藥理藥效不明，會制約了降血糖藥物的開發(fā)，因此探討天然活性成分對α-glucosidase抑制機理的研究也是現(xiàn)在迫切需要的，本課題中的研究表明葛根素是一種可逆的競爭型α-glucosidase,誘導(dǎo)了酶活性的降低；與陽性對照阿卡波糖對比，葛根素能夠明顯的抑制大鼠血糖水平的增長，對調(diào)節(jié)血糖水平起到重要作用，為臨床降血糖提供了理論基礎(chǔ)。

[1] Frost G, Wilding J, Beecham J.Dietary advice based on the glycaemic index improves dietary profile and metabolic control in type 2 diabetic patients[J].Diabet Medicine, 1994, 11(4): 397-401.

[2] Kuai R.Targeted Delivery of Cargoes into a Murine Solid Tumor by a Cell-Penetrating Peptide and Cleavable Poly(ethylene glycol) Comodified Liposomal Delivery System via Systemic Administration[J].Mol Pharmaceutics,2011,8(6),2151-2161.

[3] Charron MJ, Dubin RA, Michels CA.Structural and functional analysis of the MAL1 locus of Saccharomyces cerevisiae[J].Mol Cell Biol, 1986, 6: 3891-3899.

[4] Gray DM.Carbohydrate digestion and absorption-role of small intestine[J].New Engl J Med, 1995, 29(8): 1225-1230.

[5] Ohta T, Sasaki S, Oohori T, et al.α-Glucosidase inhibitory activity of a 70% methanol extract from ezoishige (Pelvetia babingtonii de Toni) and its effect on the elevation of blood glucose level in rats[J]. Biosci Biotechnol Biochem, 2002, 66：1552-1554.

[6] Yan JK, Zhang GW, Hu YT, et al.Effect of luteolin on xanthine oxidase: Inhibition kinetics and interaction mechanism merging with docking simulation[J].Food Chemistry, 2013, 14: 3766-3773.

[7] Li Z.Lipid-polymer hybrid nanoparticles: synthesis, characterization and applications[J].Nano Life, 2010,1(1): 163-173.

[8] Ying X, Wen H, Lu WL，et al.Dual-targeting daunorubicin liposomes improve the therapeutic efficacy of brain glioma in animals[J].J Control Release,2010,141(2):183-192.

[9] Al Soraj M.He L, Peynshaert K，et al.siRNA and pharmacological inhibition of endocytic pathways to characterize the differential role of macropinocytosis and the actin cytoskeleton on cellular uptake of dextran and cationic cell penetrating peptides octaarginine (R8) and HIV-Tat[J].J Control Release,2012,161(1):132-141.

[10] Jiang X.Solid tumor penetration by integrin-mediated pegylatedoly(trimethylene-carbonate) nanoparticles loaded with paclitaxel[J].Biomaterials,2013,34(6):1739-1746.

[11] Kimura T, Nakagawa K, Saito Y, et al.Simple and rapid determination of 1-deoxynojirimycin in mulberry leaves[J].Biofactors, 2004, 27: 341-345.

[12] Chen J, Cheng YQ, Yamaki K, et al.Anti-α-glucosidase acticity of Chinese traditionally fermented soybean (douchi)[J].Food Chemistry, 2007, 103: 1091-1096.

[13] Zhu YP, Yin LJ, Chen YQ, et al.Effect of sources of carbon and nitrogen on production of α-glucosidase inhibitor by a newly isolated strain of Bacillus subtills B2[J].Food Chemistry, 2008, 109(4):737-742.

[14] Kwon YI, Apostolidis E, Shetty K.In vitro studies of eggplant (Solanum melongena) phenolics as inhibitiors of key enzymes relevant for type2 diabetes and hypertension[J].Bioresource Technology, 2008, 99: 2981-2988.

[15] Brindis F, Rodríguez R, Bye R, et al.(Z)-3-Butylidenephthalide from Ligusticum porteri, an α-Glucosidase Inhibitor[J].J Nat Prod,2011, 74, 314-320.

[16] Yan JK, Zhang GW, Pan JH, et al.α-Glucosidase inhibition by luteolin: Kinetics, interaction and molecular docking[J].Int J Bio Macromol, 2014, 64(3):213-223.

[17] Kuai R.Efficient Delivery of Payload into Tumor Cells in a Controlled Manner by TAT and Thiolytic Cleavable PEG Co-Modified Liposomes[J].Mol Pharmaceutics,2010,7(5),1816-1826.

(編校：譚玲)

Study of the inhibitive mechanism of puerarin on α-glucosidase

XU Ting,CHU Jiang-hong,DING Ping-ying,NI Lian-songΔ

(Department of Endocrinology, Taizhou Hospital Affiliated to Wenzhou Medical University, Lin hai 317000, China)

ObjectiveTo study the inhibitory mechanism of puerarin on α-glucosidase.Methods40 male mices were divided into 5 groups:control group,acarbose group, puerarin(2.5,5.0,10) μM group,8 mices in each group.Studied the inhibitory effect and inhibition kinetics of puerarin on α-glucosidase by enzyme inhibition kinetics method,and spectrophotometer was used to determine the effect of puerarin on blood glucose change in mices.ResultsPuerarin was a reversible competitive α-glucosidase inhibitor, the value half inhibition concentration (IC50) and inhibition constant (Ki) were obtained to be (4.32±0.42) μM and (0.41± 0.09) μM, respectively.Compared with acarbos,puerarin could inhibite the increase of the blood glucose levels. ConclusionPuerarin as a competitive α-glucosidase inhibitor, can reduce the enzyme actiuity, and play an important role in fall blood ylucose level.

puerarin; α-glucosidase; inhibitory effect; blood glucose levels; diabetes

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃項目(2011KYA160)

徐婷，女，本科，副主任醫(yī)師，研究方向：糖尿病慢性并發(fā)癥及治療研究，E-mail：xutingdoc@163.com；倪連松，通訊作者，男，碩士，研究生導(dǎo)師，研究方向：糖尿病慢性并發(fā)癥發(fā)病機制及治療研究，E-mail：412168451@qq.com。

R285

A

1005-1678(2015)01-0043-04