鄧錦松 宋海霞 (.中山市神灣鎮(zhèn)銘勝養(yǎng)殖場(chǎng),廣東中山5846;.中山市海洋與漁業(yè)局漁業(yè)技術(shù)推廣站,廣東中山58400)
網(wǎng)箱養(yǎng)殖花鱸體表細(xì)菌分離鑒定與感染草魚的研究*
鄧錦松1宋海霞2
(1.中山市神灣鎮(zhèn)銘勝養(yǎng)殖場(chǎng),廣東中山528462;2.中山市海洋與漁業(yè)局漁業(yè)技術(shù)推廣站,廣東中山528400)
采用細(xì)菌分離純化方法,從患病花鱸體表分離出了5株菌株。通過生化試驗(yàn)和細(xì)菌16SrRNA基因序列測(cè)定,5株細(xì)菌初步鑒定I為野菊微小桿菌;II為乙酰微小桿菌;III-V為巨型球菌。用5株細(xì)菌分別感染健康草魚,5株細(xì)菌均具有致病性。在5個(gè)菌株中,巨型球菌對(duì)草魚的危害較大。
鱸魚;細(xì)菌;分子鑒定;16SrRNA
近年來,魚病發(fā)生頻繁,尤其是細(xì)菌性魚病的暴發(fā),給養(yǎng)殖戶造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失。為了掌握危害魚類較大的病菌種類、同種細(xì)菌在不同種魚之間的相互傳播規(guī)律。
本研究對(duì)從患病花鱸體表分離的細(xì)菌菌株,通過形態(tài)學(xué)觀察及一系列生理生化試驗(yàn),并采用16SrRNA基因序列測(cè)定,測(cè)序結(jié)果輸入到NCBI中,用BLAST工具,對(duì)序列進(jìn)行同源性對(duì)比分析進(jìn)行鑒定[1],并把分離的各菌株細(xì)菌分別對(duì)健康草魚進(jìn)行感染試驗(yàn),觀察鱸魚致病細(xì)菌對(duì)草魚產(chǎn)生的影響,驗(yàn)證其致病性。
1.1 材料
1.1.1 病原菌來源
患病花鱸于2013年5月采自饒平縣北部的湯溪水庫(kù)上游養(yǎng)殖場(chǎng),從患病花鱸體表分離細(xì)菌。
1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物
來源于同一養(yǎng)殖場(chǎng)的健康草魚300條。
1.2 菌株分離及細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察
用無菌棉簽沾取患病花鱸的體表處,分別涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上,在27℃恒溫箱中培養(yǎng)12h,將長(zhǎng)出的不同菌落分別轉(zhuǎn)接培養(yǎng),直到一個(gè)平板中只長(zhǎng)有一個(gè)菌落[2]。然后將菌株分別接種到LB液體培養(yǎng)基中,并將其放入27℃的恒溫?fù)u床中進(jìn)行搖菌12h,后分別將菌液濃度稀釋為1× 10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6進(jìn)行凃板,培養(yǎng)后對(duì)菌落的厚薄、大小、表面、邊緣、隆起形狀、顏色等情況進(jìn)行觀察并記錄。另挑取單菌落接種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上,培養(yǎng)12h后進(jìn)行革蘭氏染色,觀察現(xiàn)象并記錄結(jié)果。
1.3 細(xì)菌鑒定
1.3.1 基因組DNA提取
取適量細(xì)菌于1ml無菌水的Ep管中,12000r/ min離心5min,吸去上清液,收集菌體。向Ep管中加入600μL裂解液(30mmol/Ltris-HCl,0.1mol/LEDTA,0.1mol/LNaCl,1%SDS,pH8.0)、20μL10mg/mL的蛋白酶K,充分混勻后置于55℃水浴1h。12000r/min離心5min,取上清液,向上清液中加入飽和酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提后,12000r/min離心5min,取上清液,并向上清液加2倍體積的無水乙醇,冰上放置10min,12000r/ min離心5min,去掉上清液,置室溫干燥后,溶于30μLTE緩沖液,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3.2 PCR擴(kuò)增
反應(yīng)體系如下:10×PCRbuffer5μL;25mol/L MgCl5μL;10uM引物各1ul;模板DNA5μL;Taq酶0.5μL;補(bǔ)足雙蒸水至50μL。其中,PCR擴(kuò)增的引物是由上海生工生物服務(wù)有限公司合成的FP (5'-GATTAGATACCCTGGTAGTCCAC-3')和RP (5'-CCCGGGAACGTATTCACCG-3')。反應(yīng)程序:94℃5min;(94℃30s;55℃30s;72℃1min) x30;72℃5min。
1.3.3 電泳
利用2%瓊脂糖凝膠電泳(3V/cm,1.5h)檢驗(yàn)總DNA的提取和PCR反應(yīng)結(jié)果。
1.3.4 測(cè)序
由上海生工生物服務(wù)有限公司完成。
1.3.5 序列分析
利用BLAST工具,對(duì)測(cè)定的細(xì)菌基因序列進(jìn)行同源性對(duì)比分析,從而對(duì)細(xì)菌菌株進(jìn)行鑒定。
1.4 細(xì)菌的生理生化試驗(yàn)
將花鱸體表的不同菌株分別接種在已制備好的各含有蔗糖、乳糖、麥芽糖、淀粉和甘露醇五種糖類的糖發(fā)酵管中進(jìn)行糖酵解試驗(yàn)[3],在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2~3d后,觀察現(xiàn)象并記錄結(jié)果。按照常規(guī)方法對(duì)花鱸體表細(xì)菌進(jìn)行糖酵解試驗(yàn)、檸檬酸鹽培養(yǎng)基試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、尿素分析試驗(yàn)、V-P和甲基紅生理生化試驗(yàn)。
1.5 細(xì)菌的回復(fù)感染
感染試驗(yàn)前將菌株分別接種在制備好的LB液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)12h,用平板菌落計(jì)數(shù)法[4]測(cè)定細(xì)菌原菌液中活菌數(shù)目,細(xì)菌菌株濃度(細(xì)菌密度)均為:106~107個(gè)/ml。
用于回復(fù)感染的健康草魚平均體長(zhǎng)為10~15cm,體重150~200g,分五組,每組50條,同時(shí)設(shè)一對(duì)照組。將純化的單一細(xì)菌菌液以肌肉注射(1 ml/尾)方式感染到試驗(yàn)草魚胸鰭下的肌肉處,對(duì)照組注射相同劑量的蒸餾水。將以上試驗(yàn)魚置于60×30×28cm㎝的長(zhǎng)方形的養(yǎng)魚箱中,持續(xù)充氧,連續(xù)觀察一周。
圖1 部分菌株的菌落形態(tài)(注:a為鱸體表II,b為鱸體表III)
2.1 菌落外部形態(tài)和革蘭氏染色結(jié)果
將純化后的培養(yǎng)基取出,對(duì)細(xì)菌菌落的厚薄、大小、表面、邊緣、隆起形狀、顏色等進(jìn)行觀察(見圖1)。革蘭氏染色在油鏡下觀察(見圖2).通過比較外部形態(tài)及油鏡觀察結(jié)果,得到5個(gè)菌株,其外部形態(tài)和革蘭氏染色結(jié)果見表1。
圖2 部分菌落油鏡下的細(xì)菌形態(tài)(注:a為鱸體表II,b為鱸體表III)
表1 細(xì)菌菌落形態(tài)觀察和革蘭氏染色結(jié)果
2.2 菌株鑒定
對(duì)16SrRNA基因部分序列正反方向測(cè)序的結(jié)果進(jìn)行拼接,結(jié)果輸入到NCBI(http://www.ncbi. nlm.nih.gov/)中,用BLAST工具,對(duì)序列進(jìn)行同源性對(duì)比分析,所得結(jié)果見表2。
表25 個(gè)菌株與相似序列的菌種名稱、登錄號(hào)及同源性
2.3 細(xì)菌的生理生化試驗(yàn)
對(duì)五菌株進(jìn)行的糖酵解及其它生理生化試驗(yàn),通過實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì),其結(jié)果見表3和表4。
2.4 細(xì)菌回復(fù)感染
將初步鑒定的5種細(xì)菌分別接種到健康草魚,5種細(xì)菌對(duì)草魚均治病、開始死亡時(shí)間、死亡率、主要癥狀有不同程度的影響,其結(jié)果見圖3及表5。
表3 細(xì)菌糖酵解試驗(yàn)結(jié)果
表4 細(xì)菌生理生化試驗(yàn)結(jié)果
表55 株細(xì)菌回復(fù)感染結(jié)果
圖3 部分菌株回復(fù)感染后的癥狀
本研究用微生物學(xué)常用的細(xì)菌分離純化方法,從患病花鱸體表分離出了5株菌株。通過分子生物學(xué)鑒定和生化試驗(yàn),5株細(xì)菌初步鑒定I為野菊微小桿菌;II為乙酰微小桿菌;III為巨型球菌HT6;IV為巨型球菌JCSC5402;V為細(xì)菌MM5。
在淡水魚類養(yǎng)殖中,常見的細(xì)菌性魚病主要有爛鰓病、腸炎病、敗血癥和赤皮病等。在草魚細(xì)菌引起的疾病研究中,祖國(guó)掌(2001)的研究表明,草魚細(xì)菌性疾病,主要為細(xì)菌性敗血癥、細(xì)菌性爛鰓病、細(xì)菌性腸炎和細(xì)菌性綜合癥等4種,而氣單胞菌是草魚患病的主要條件致病菌[5]。在患病花鱸體內(nèi)細(xì)菌分離與分子鑒定研究中,王慶容(2010)的研究表明,引起花鱸患病的主要致病菌是嗜水氣單胞菌和殺鮭氣單胞菌[6]。目前,有關(guān)嗜水氣單胞菌引起魚類及其他水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物疾病的記載和報(bào)道已較多見,在世界不少國(guó)家和地區(qū)均檢出該菌,且已對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重危害。同時(shí)還可引起魚類、兩棲類、爬行類以及哺乳動(dòng)物發(fā)?。?-10]。但目前未見研究對(duì)野菊微小桿菌、乙酰微小桿菌、巨型球菌HT6、巨型球菌JCSC5402和細(xì)菌MM5對(duì)魚類和其它動(dòng)物致病報(bào)導(dǎo),因而本研究從患病鱸魚體表分離出的5株菌株的鑒定及致病性,為了解和掌握魚類致病病源菌種類、為以后研究魚病防治奠定基礎(chǔ)。
從患病花鱸體表提取分離的細(xì)菌感染健康草魚,5株細(xì)菌均具有致病性,說明這些細(xì)菌并不是單一感染致病一種魚類,能夠相互交叉感染,而且每種細(xì)菌的致病、致死結(jié)果各不相同。從5種細(xì)菌回復(fù)感染草魚的結(jié)果表明,細(xì)菌MM5與巨型球菌HT6,對(duì)草魚的危害較大,感染后2d開始死亡,一星期后死亡率最高。
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S965.211
B
1006-3188(2015)04-0033-05
2015-11-13
1第一作者:鄧錦松(1979.11-),碩士,水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)員,研究方向?yàn)樗a(chǎn)養(yǎng)殖生態(tài)學(xué),電子郵箱:jsdeng79@163.
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