關(guān)于魚類病毒病診斷技術(shù)的探討

何海龍 李慶東 康 萌

（ 黑龍江省饒河大馬哈魚放流試驗站 黑龍江 哈爾濱 150018）（ 黑龍江省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站 黑龍江 哈爾濱 150018）（ 黑龍江省漁業(yè)經(jīng)濟研究所 黑龍江 哈爾濱 150018）

一、魚類病毒病的發(fā)生特點

一是養(yǎng)殖品種不明病因的疾病增加；二是疾病種類、復(fù)合發(fā)病多，往往是同一片池塘可同時發(fā)生不同的病害，造成控制難度大；三是病程時間長，發(fā)病面積廣，一些病害全年均有發(fā)生；四是一些疾病在局部地區(qū)暴發(fā)性頻率增加，病害控制難度非常大，造成重大經(jīng)濟損失。

二、病毒及魚類病毒病的主要特點

病毒的概念：病毒是一類超顯微的非細胞生物（絕大多數(shù)病毒是能通過細菌濾器的微小顆粒，因此必須通過電子顯微鏡才能觀察其具體形態(tài)和大?。?，每一種病毒只含有一種核酸，或是DNA，或是RNA；它們只能在活細胞內(nèi)營專性寄生，靠其宿主代謝系統(tǒng)的協(xié)助來復(fù)制核酸、合成蛋白質(zhì)等組分，然后再進行裝配而得以增殖；在離體條件下，它們能以無生命的化學(xué)大分子狀態(tài)長期存在并保持其侵染活性。

魚類病毒病的主要特點：一是魚類感染病毒性疾病有潛伏期，只有在一定的溫度條件下才發(fā)??；二是病毒病往往來勢兇猛，可造成養(yǎng)殖魚類的全軍覆滅；三是在魚體內(nèi)殺死病毒非常困難，只有以預(yù)防為主，不讓魚與病毒接觸。

三、PCR 技術(shù)

1、PCR 是近十年來發(fā)展和普及最迅速的分子生物學(xué)新技術(shù)之一，是一項在短時間內(nèi)大量擴增特定的DNA 片斷的分子生物學(xué)技術(shù)，它具有強大的擴增能力，敏感性和特異性大大增強。由于PCR對世界生物醫(yī)學(xué)研究的巨大推動作用，其發(fā)明者Saiki 因而獲得1992年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎。

2、PCR 技術(shù)原理

PCR 通常需要兩個位于待擴增片斷兩側(cè)的寡聚核苷酸引物。這些引物分別于待擴增片段的兩條鏈互補并定向，使兩引物之間的區(qū)域得以通過聚合酶而擴增。反應(yīng)過程為首先必須使得待擴增DNA（稱為模板）置于高溫下解鏈成單鏈模板，這一過程叫變性。第二步為分別與待擴增的DNA 片段兩條鏈的3′端互補的人工合成的寡聚核苷酸引物在低溫條件下分別與模板兩條鏈兩側(cè)互補結(jié)合，這一過程叫退火。第三步是DNA 聚合酶在適當(dāng)溫度下將脫氧核苷酸沿引物5′-3′方向延伸合成新股DNA，這一過程叫延伸。變性—退火—延伸，如此循環(huán)往復(fù)，每一循環(huán)產(chǎn)生的新股DNA 均能成為下一次循環(huán)的模板，故PCR 產(chǎn)物是以指數(shù)方式，即2n 擴增的，經(jīng)過30-35 個循環(huán)，目的片段可以擴增到100 萬倍，在一般PCR 儀上，完成這樣的反應(yīng)需幾個小時。

PCR 體系中的基本要素是：（1）DNA 模板可以是單鏈或雙鏈，可以是提取的染色體DNA，亦可是克隆的質(zhì)粒DNA；可以是線性，亦可是環(huán)狀DNA 分子。（2）一對寡聚DNA 引物，分別與模板DNA鏈兩側(cè)的3′端序列互補，可使二者間的DNA 序列得到擴增。（3）耐熱DNA 聚合酶通常是TaqDNA聚合酶與其它類似物，可在高溫下（72℃）催化DNA 合成，并且加熱至95℃不會變性。（4）緩沖液提供DNA 合成反應(yīng)所需pH、離子強度等環(huán)境。（5）4 種單核苷酸（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）提供DNA合成的原料。

3、實驗材料

器材：離心機、PCR 擴增儀、PCR 反應(yīng)管、冰盒、水平式電泳凝膠設(shè)備、TIP、加樣器、紫外燈、冰箱、冰柜等。

試劑：模板DNA、PCR 引物、TaqDNA 聚合酶、dNTPS、10×PCR 反應(yīng)緩沖液、氯化鎂、去離子水、紫外燈、礦物油。

4、實驗方法

（1）、基本PCR 技術(shù)擴增方案

按下列程序依次加入試劑，按50ul 反應(yīng)體積配制反應(yīng)體系（注意：水先加，然后依次加入其他試劑，模板DNA 最后加）。

按表1 將各成分依次加到0.2mlPCR 反應(yīng)專用薄壁管內(nèi)[注意：實驗中應(yīng)設(shè)立對照。陰性對照（不加模板DNA）可加去離子水代替]。

表1 各實驗成分的加入方法

陽性對照（含目的序列DNA）

將上述液體混合，短暫離心以集中液體，置PCR 儀依表2 所述條件進行反應(yīng)。

（2）PCR 產(chǎn)物的凝膠電泳檢測

取5ulPCR 反應(yīng)液置瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)溴化乙啶染色后在紫外燈下觀察結(jié)果。成功的擴增結(jié)果應(yīng)為明顯的，單一的熒光帶，并和預(yù)先設(shè)計的片段大小一致。

注意：上述所介紹的實驗方法為基本PCR 技術(shù)方法。在實際檢測過程中，要根據(jù)所要檢測的具體種類的魚類病毒，使用該類病毒檢測的標準方法。

5、注意事項

PCR 反應(yīng)體系中的任何一個成分，對其結(jié)果都是非常重要的。由于PCR 是以指數(shù)方式擴增加，極微量的DNA 污染都可能造成假陽性結(jié)果，因此反應(yīng)體系的干凈程度是非常重要的。需要實驗者在操作中加以注意的問題如下：

（1）合理分隔實驗室:根據(jù)各實驗室不同的條件可分為樣品的處

理、配制反應(yīng)液、循環(huán)擴增及產(chǎn)物的鑒定4 部分。實驗前應(yīng)用紫外線消毒以破壞殘留的DNA 及RNA。

（2）分裝PCR 試劑：所有的PCR 試劑都應(yīng)小量分裝，-20℃保存。

（3）設(shè)立適當(dāng)?shù)年栃詫φ蘸完幮詫φ眨簽榇_保結(jié)果的可肯定性，每次反應(yīng)都應(yīng)有設(shè)置嚴格的對照：一是陽性對照，陽性模板；二是陰性對照，不含有被擴增核酸的樣品作陰性對照；三是空白對照（或試劑對照），一管不加模板的試劑對照。

（4）防止操作人員污染：盡量一次性使用手套、吸頭、離心管。選擇質(zhì)量好的PCR 反應(yīng)管，打開離心管前應(yīng)先離心，開管動作要輕，以防管內(nèi)液體濺出。

（5）加樣器：由于操作時不慎將樣品或模板核酸吸入槍內(nèi)或粘上槍頭是一個嚴重的污染源，因此吸樣要慢，盡量一次性完成，忌多次抽取，以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠造成污染。設(shè)置專用的加樣器用于PCR，這套加樣器不能用于PCR 的反應(yīng)產(chǎn)物分析。

表2 反應(yīng)條件