HBX蛋白反式激活基因XTP4抑制HepG2細(xì)胞凋亡

時朝輝，張夢然，王麗麗，劉順愛，梁 璞，吳 君，成 軍*，梁躍東*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)， 貴州 貴陽 550004； 2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院 傳染病研究所， 北京 100015)

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研究論文

HBX蛋白反式激活基因XTP4抑制HepG2細(xì)胞凋亡

時朝輝1，張夢然2，王麗麗1，劉順愛2，梁 璞2，吳 君1，成 軍2*，梁躍東1*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)， 貴州 貴陽 550004； 2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院 傳染病研究所， 北京 100015)

目的探討乙型肝炎病毒X蛋白(HBXAg)反式激活基因4(XTP4)對肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞HepG2細(xì)胞凋亡的影響。方法構(gòu)建XTP4基因的真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1/myc-His(-)A-XTP4(pXTP4)及化學(xué)合成XTP4基因的干擾RNA(siXTP4)后，分別將XTP4基因的真核表達質(zhì)粒、干擾RNA及各自的陰性對照(NC、siNC)瞬時轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞中，48 h后進行以下實驗:用Western blot驗證XTP4在蛋白水平的過表達和干擾表達；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡；Western blot 檢測Bcl- 2、Bax蛋白水平并計算Bcl- 2/Bax比值；化學(xué)發(fā)光法檢測胱冬肽酶- 3(caspase- 3)的活性。結(jié)果成功構(gòu)建了XTP4的真核表達質(zhì)粒pXTP4、XTP4在蛋白水平過表達和干擾表達。與各自的陰性對照組相比，過表達XTP4的HepG2細(xì)胞中，Annexin V+細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.05)，Bcl- 2/Bax比值增高(P<0.05)，胱冬肽酶- 3活性下降(P<0.05)；而干擾XTP4表達的HepG2細(xì)胞中，Annexin V+細(xì)胞數(shù)顯著增加(P<0.05)，Bcl- 2/Bax比值降低(P<0.05)，胱冬肽酶- 3活性上升(P<0.05)。 結(jié)論XTP4具有抑制HepG2細(xì)胞凋亡的作用，可能是通過增加Bcl- 2/Bax的比值實現(xiàn)。

XTP4基因；HepG2細(xì)胞；細(xì)胞凋亡

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染呈世界性流行,全球有3.5億人為慢性HBV感染者,每年約有100萬人死于HBV感染所致疾病[1],據(jù)2006年全國乙肝流行病學(xué)調(diào)查表明,中國1～59歲一般人群乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)攜帶率為7.18%[2]。乙型肝炎病毒X蛋白(HBxAg)是由HBV最小的開放讀碼框X基因編碼的病毒蛋白，因其與所有的已知蛋白沒有同源性，故命名為X蛋白,X基因片段是HBV最主要整合片段，X蛋白也是惡性轉(zhuǎn)化肝細(xì)胞中主要表達的病毒蛋白[3]。研究表明，HBxAg是一種多功能的調(diào)節(jié)蛋白，具有廣泛的反式激活功能，其通過反式激活作用，調(diào)控肝細(xì)胞某些基因的表達，影響細(xì)胞凋亡、分化、增殖等生物學(xué)功能，在HBV致病、致癌過程中發(fā)揮重要作用,但其具體機制尚不完全明了[4]。本課題組于2004年應(yīng)用抑制性消減雜交技術(shù)篩選并克隆了HBXAg反式激活靶基因4(XTP4)[5]，本研究旨在探討XTP4對HepG2細(xì)胞凋亡的影響，以明確XTP4是否通過對細(xì)胞凋亡的影響參與HBV相關(guān)肝病的發(fā)病與進展。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細(xì)胞、質(zhì)粒和siRNA:HepG2細(xì)胞、pcDNA3.1/myc-His(-)A質(zhì)粒(均本實驗室保存)；siRNA(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成)，陰性對照(siNC)為吉瑪公司提供的與目的序列無同源性的通用陰性對照。序列如下：siNC：sense 5′-UUC UCCGAACGUGUCACGUTT- 3′,antisense 5′-ACGUG ACACGUUCGGAGAATT- 3′;siXTP4：sense 5′-UCU GGGUUCCUGCUCUGUUTT- 3′,antisense 5′-AACAG AGCAGGAACCCAGATT- 3′。

1.1.2 試劑:DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清(Gibco公司)；jet PRIMETM DNA&siRNA轉(zhuǎn)染試劑(Polyplus公司)；細(xì)胞凋亡檢測試劑AnnexinV-FITC和7-AAD(Biolegend公司)；胱冬肽酶- 3發(fā)光檢測試劑盒(Promega公司)。One Step RNA PCR試劑盒和pGEM-Teasy載體等[寶生物工程(大連)有限公司]。兔抗人XTP4抗體(Abcame公司)；抗-myc標(biāo)簽、抗-Bcl- 2、抗-Bax、抗-GAPDH、山羊抗兔IgG-HRP和山羊抗鼠IgG-HRP(Santa公司)。

1.2 方法

1.2.1 真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建:提取HepG2細(xì)胞中的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此為模板PCR擴增XTP4基因全長片段；PCR引物根據(jù) NCBI中提交的 XTP4 的基因序列設(shè)計，進行PCR反應(yīng)后瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴增結(jié)果并進行切膠純化回收。將回收產(chǎn)物連接TA載體進行序列測定，經(jīng)XhoⅠ和EcoRⅤ雙酶切后將目的基因連接到真核表達載體pcDNA3.1/myc-His(-)A中，構(gòu)建的表達載體進行酶切和測序鑒定。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染:用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，于5% CO2孵箱中培養(yǎng)HepG2細(xì)胞；待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底后，將細(xì)胞傳代種植于6孔板中，待細(xì)胞達60%～70%匯合度時進行重組質(zhì)粒和干擾RNA的轉(zhuǎn)染，并設(shè)立各自的陰性對照。

1.2.3 Western blot驗證XTP4蛋白的過表達和干擾表達:質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h后提取細(xì)胞總蛋白，進行 Western blot，一抗為抗-myc標(biāo)簽、兔抗人XTP4抗體、抗-GAPDH，二抗為山羊抗鼠IgG-HRP、山羊抗兔IgG-HRP。

1.2.4 Annexin V檢測細(xì)胞凋亡：轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，按照Annexin V/7-AAD檢測試劑說明書處理細(xì)胞后利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。Annexin V-7-AAD-為正常細(xì)胞；Annexin V+7-AAD-為早期凋亡細(xì)胞；Annexin V+7-AAD+為中晚期凋亡細(xì)胞。

1.2.5 Western blot檢測Bcl- 2、Bax蛋白表達:轉(zhuǎn)染48 h后提取細(xì)胞總蛋白，按照常規(guī)方法進行Western blot檢測。一抗為抗-Bcl- 2、抗-Bax、抗-GAPDH，二抗為山羊抗兔IgG-HRP、山羊抗鼠IgG-HRP。應(yīng)用 IMAGEPROPLUS 軟件進行灰度分析。

1.2.6 胱冬肽酶- 3(caspase- 3)的活性檢測:將HepG2細(xì)胞以每孔1×104個細(xì)胞接種于96孔板中，轉(zhuǎn)染后48 h，按照胱冬肽酶- 3化學(xué)發(fā)光試劑盒的操作流程處理細(xì)胞后檢測細(xì)胞內(nèi)胱冬肽酶- 3的活性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建XTP4的真核表達載體pcDNA3.1/myc-His(-)A-XTP4

用RT-PCR擴增出XTP4，擴增片段約348 bp，與預(yù)期符合(圖 1A)。酶切鑒定可見5 500 bp大小的pcDNA3.1/myc-His(-)A線性片段以及348 bp的XTP4基因片段(圖 1B)。經(jīng)測序，序列比對完全一致，表明XTP4基因的真核表達載體構(gòu)建成功。

A:1.DNA marker 2000, 2.RT-PCR product; B：1.DNA marker 2000, 2.pXTP4 enzyme products圖1 XTP4真核表達載體的構(gòu)建Fig 1 The construction of eukaryotic expression vector of XTP4

2.2 Western blot驗證XTP4在蛋白水平的過表達和干擾表達

轉(zhuǎn)染48 h后 Western blot，抗-myc標(biāo)簽、抗-XTP4、抗-GAPDH，驗證了 XTP4蛋白的過表達和干擾表達，XTP4蛋白相對分子質(zhì)量約為12 ku， pcDNA3.1/myc-His(-)A-XTP4(pXTP4)因有myc、His標(biāo)簽，蛋白相對分子質(zhì)量約為17 ku，與預(yù)期相符(圖2)。

NC.normal controls；pXTP4.pcDNA3.1/myc-His(-)A-XTP4；siNC.siRNA normal controls；siXTP4.XTP4 small interference RNA圖2 Western blot驗證XTP4過表達和干擾表達Fig 2 Western blot verified the overexpression and interference expression of XTP4

2.3 XTP4對Annexin V+細(xì)胞數(shù)的影響

與各自的對照組相比，過表達XTP4后Annexin V+細(xì)胞數(shù)顯著減少，總凋亡率顯著減少(P<0.01)；干擾XTP4表達后Annexin V+細(xì)胞數(shù)顯著增加，總凋亡率顯著增加(P<0.01)(圖3)。

2.4 XTP4對Bcl- 2/Bax 比值的影響

與各自的對照組相比，過表達XTP4 組Bcl- 2/Bax的比值升高(P<0.01)，干擾XTP4表達組Bcl- 2/Bax的比值降低(P<0.01)(圖4)。

2.5 XTP4對胱冬肽酶- 3活性的影響

與各自的對照組相比，過表達XTP4組胱冬肽酶- 3的活性下降(P<0.05)，干擾XTP4組胱冬肽酶- 3的活性增加(P<0.05)(圖5)。

3 討論

XTP4最早由美國國立衛(wèi)生研究院哺乳動物基因集合(MGC)計劃通過代表性差異分析技術(shù)于2002年發(fā)現(xiàn)，并命名為C17orf37/MGC14832[6]，在Gene bank 中的別名還有C35、M1EN1、RDX12 和ORB3等。 XTP4蛋白質(zhì)編碼區(qū)全長348 bp，位于人類染色體17q12-17q21，腫瘤研究的熱點HER2擴增子內(nèi)，由4個外顯子，3個內(nèi)含子組成。目前已有研究發(fā)現(xiàn)XTP4在多種惡性腫瘤中高表達(乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌)，與乳腺癌的分級、分期明顯相關(guān)，具有促進腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的作用，而且與腫瘤的耐藥相關(guān)[7- 11]。

本課題組前期應(yīng)用基因芯片技術(shù)和抑制性消減雜交技術(shù)篩選了XTP4反式調(diào)節(jié)基因和差異表達基因[12- 13]，提示XTP4可能參與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖與分化、肝細(xì)胞纖維化、 腫瘤發(fā)生等多種生物學(xué)過程，提示XTP4可能在HBV相關(guān)肝病的發(fā)生中起著重要作用，其機制研究對于進一步了解HBV相關(guān)肝病的發(fā)病機制具有重要意義。

*P<0.01 compared with NC; #P<0.01 compared with siNC

A.Western blot detected the expression of Bcl- 2, Bax protein；B.the ratio of Bcl- 2 to Bax results statistical figure; *P<0.01 compared with MC; #P<0.01 compared with siNC圖4 XTP4對Bcl- 2/Bax比值的影響Fig 4 The influence of XTP4 on the ratio of Bcl- 2 to Bax(n=6)

*P<0.01 compared with NC; #P<0.01 compared with siNC圖5 XTP4對胱冬肽酶- 3活性的影響Fig 5 The influence of XTP4 on the activities of caspase- 3(n=6)

本研究Annexin V/7AAD結(jié)果顯示，過表達XTP4可以使HepG2細(xì)胞凋亡率顯著減少，而干擾XTP4的表達可以使HepG2細(xì)胞凋亡率顯著增加。表明XTP4的高表達可以抑制HepG2細(xì)胞的凋亡，而下調(diào)XTP4的表達將加速HepG2細(xì)胞的凋亡。

Bcl- 2家族在凋亡的調(diào)控中起到關(guān)鍵作用，尤其是Bcl- 2/Bax比值被稱作是啟動細(xì)胞凋亡的分子開關(guān)[14]。在各種外界因素刺激下，Bcl- 2/Bax比值發(fā)生變化，通過影響凋亡執(zhí)行分子胱冬肽酶- 3(caspase- 3)，最終決定細(xì)胞的凋亡與否。通過Western blot檢測過表達和干擾XTP4表達后Bcl- 2/Bax比值的變化情況，發(fā)現(xiàn)過表達XTP4后Bcl- 2/Bax比值增加，干擾XTP4的表達后Bcl- 2/Bax比值下降。進一步研究證實，過表達XTP4后，胱冬肽酶- 3的活性降低；干擾XTP4表達后，胱冬肽酶- 3的活性增加。表明XTP4的高表達可以上調(diào)Bcl- 2/Bax比值，降低胱冬肽酶- 3的活性，抑制HepG2細(xì)胞的凋亡，而下調(diào)XTP4的表達將下調(diào)Bcl- 2/Bax比值，增強胱冬肽酶- 3的活性加速凋亡。

綜上所述，XTP4通過增加Bcl- 2/Bax比值，抑制HepG2細(xì)胞的凋亡，參與HBV致病過程。然而XTP4對Bcl- 2/Bax比值的調(diào)控作用通過哪些調(diào)控水平來實現(xiàn)及其確切的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)機制有待進一步研究。XTP4是否通過其他凋亡途徑影響腫瘤細(xì)胞的凋亡，如死亡受體途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑等，以及這些途徑與上調(diào)Bcl- 2/Bax比值間是否存在相互作用有待進一步研究。

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HBX protein trans-activate geneXTP4 suppresses HepG2 cells apoptosis

SHI Chao-hui1, ZHANG Meng-ran2, WANG Li-li1, LIU Shun-ai2, LIANG Pu2, WU Jun1, CHENG Jun2*, LIANG Yue-dong1*

(1.Guizhou Medical University,Guiyang 550004; 2.Institute of Infectious Diseases,Beijing Ditan Hospital, Capital Medical University,Beijing 100015,China)

Objective To explore the effects of HBX protein trans-activate gene XTP4 on cell apoptosis of HepG2 cells. Methods The plasmid pcDNA3.1/myc-His (-)A-XTP4 (pXTP4) was constructed,XTP4 gene interference RNA(siRNA) was chemically synthesized. And then negative control(NC,siNC) was transiently transfected into HepG2 cells respectively.The following experments were carried out post 48 hours: Western blot was used to for confirming the overexpression and interference expression of XTP4 protein.Flow cytometry was used to observe cell apoptosis.While Bcl- 2、Bax protein were semiquantified by Western blot,and then the ratio of Bcl- 2 to Bax was caculated. The activities of caspase- 3 were detected by caspase- glo 3/7 luminometer respectively.Results The plasmid pXTP4 was successfully constructed,XTP4 protein overexpressed and interferenced. Compared with control group respectively, the number of Annexin V-positive cells was decreased (P<0.05), the ratio of Bcl- 2 to Bax upregulated (P<0.05),the activity of caspase- 3 were reduced in pXTP4(P<0.05).While the number of Annexin V-positive cells was increased (P<0.05),the ratio of Bcl- 2 to Bax downregulated (P<0.05), the activity of caspase- 3 were increased in siXTP4(P<0.05). Conclusions The apoptosis of HepG2 was suppressed by XTP4,and the possible mechanism may be explained by the upregulate of Bcl- 2/Bax.

XTP4 gene; HepG2 cells; apoptosis

2015-07 - 01

2015- 10- 16

國家自然科學(xué)基金(81470863)；北京市醫(yī)院管理局重點醫(yī)學(xué)專業(yè)發(fā)展計劃(ZYLX201402)

1001-6325(2015)12-1591-05

R735.7

A

*通信作者(corresponding author)：chengjdt@ccmu.edu.cn；lyd302@163.com