張維誼 袁萬軍 王 建 徐 鋒 沈麗萍

(上海市動物疫病預防控制中心,上海 201103)

PCR檢測上海地區(qū)豬痢疾短螺旋體、大腸毛狀短螺旋體和胞內勞森菌

張維誼 袁萬軍 王 建 徐 鋒 沈麗萍

(上海市動物疫病預防控制中心,上海 201103)

2014年10月至2015年10月,從上海市動物疫病預防控制中心門診、上海地區(qū)規(guī)?；i場、屠宰場等采集的回腸、糞便及肛門拭子共254份樣本,結合臨床表現、病理剖檢進行初步鑒定,并通過建立的豬痢疾短螺旋體、大腸毛狀短螺旋體和胞內勞森菌多重PCR方法進行鑒定。檢測結果顯示:豬痢疾短螺旋體陽性7份,大腸毛狀短螺旋體陽性為0,胞內勞森菌陽性33份;陽性率分別為2.75%,0,13.0%。結果表明目前上海地區(qū)豬痢疾短螺旋體和胞內勞森菌均存在不同程度的感染和流行,這兩種病原均可造成嚴重的經濟損失,應當引起足夠重視,檢測結果可在制定本地區(qū)豬腹瀉病的防控策略中作為參考。通過胞內勞森菌套式PCR方法檢測,結果發(fā)現共有36份陽性,陽性率為14.2%。

豬痢疾短螺旋體;大腸毛狀短螺旋體;胞內勞森菌; PCR;檢測

豬腸道疾病綜合征一直是困擾養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重大難題，為做到有的放矢的預防和治療，進行正確的診斷是關鍵前提。根據相關文獻報道，在引起腸道疾病的傳染性病原中豬腸道螺旋體和胞內勞森菌是關鍵性病原，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成重大經濟損失。胞內勞森菌是回腸炎（PE）的病原，豬痢疾短螺旋體可導致豬痢疾（SD），大腸毛狀短螺旋體是引起結腸螺旋體病的病原[1-2]。

胞內勞森菌不能用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)，兩種螺旋體培養(yǎng)條件也比較苛刻，都很難培養(yǎng)并正確鑒別。然而控制這三種不同疾病的傳播首要的是做出正確的診斷，繼而采取相應的防控措施。之前，在瑞典野豬群中曾檢測到過這三種病原[3]。多重PCR方法的應用為快速診斷三種關鍵性腸道疾病起到了重要作用

了解B.hyo、B.pilo、LI在上海地區(qū)的流行狀況及其特點對豬腸道疾病的有效預防和控制將具有重要價值，同時對上海地區(qū)養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展也有一定促進作用。本試驗從臨床門診、規(guī)?；i場、屠宰場等地采集腸道、糞便及肛拭子樣本分別進行多重PCR檢測和套式PCR檢測，以獲得上海地區(qū)B.hyo、B.pilo、LI流行狀況的數據，并為制定合理的防控措施提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 標準菌株及檢測樣本

胞內勞森菌B3903株（購自Boehringer Ingelheim），豬痢疾短螺旋體（B78）、大腸毛狀短螺旋體（P43/6/78）由德國吉森大學Werner Herbst 博士惠贈。

自2014年10月至2015年10月共從上海市動物疫病預防控制中心門診（散養(yǎng)戶豬場）腹瀉病例中檢測樣本59份，屠宰場樣品125份，上海地區(qū)規(guī)?；i場樣本70份，共計254份。其中腸組織樣本220份，糞便樣本24份，肛拭子10份。

1.1.2 主要試劑

血液、組織DNA提取試劑盒和糞便DNA提取試劑盒（均購自QIAGEN公司），PCR premix 2×（Takara），DNA Marker（TIANGEN），TAE緩沖液（上海雙螺旋），溴化乙錠（Ethidium bromide，EB），DEPC水，無水乙醇等。

1.1.3 主要儀器設備

高速冷凍離心機（Eppendorf），微量移液器，超凈工作臺（LABCONCO），普通PCR儀（Bio Rad），電子天平（METTLER），恒溫水浴鍋，凝膠成像系統（CHEMI GENIUS），核酸電泳儀（購自天能生物公司）等。

1.1.4 引物

參考Genebank序列，分別設計針對LI、B.hyo、B.pilo的多重引物[4]（見表1），送上海invitrogen公司合成。所合成的引物均先用DEPC水稀釋成濃度20pmol/μl后在用于PCR反應。

1.2 方法

1.2.1 樣本核酸的提取

腸道粘膜組織DNA的提取和糞便及肛門拭子DNA的提取分別按QIAGEN血液、組織DNA提取試劑盒和QIAGEN糞便DNA提取試劑盒說明書進行操作。

1.2.2 胞內勞森菌、豬痢疾短螺旋體和大腸毛狀短螺旋體多重PCR方法

25μl反應體系：PCR premix 2× 12.5μl，L1/L2、H1/H2、P1/P2 各1μl，DEPC水 3.5μl，DNA模板 3μl。反應程序為：95℃ 10min；95℃ 30s，58℃ 90s，68℃ 2min，35個循環(huán)；68℃10min。PCR產物以1%凝膠電泳，并用凝膠成像分析系統觀察結果。

1.2.3 多重PCR方法應用

對采集的254份樣本核酸進行多重PCR檢測，并將檢測結果分類匯總。

表1 多重PCR及套式PCR引物

2 結果

2 結果

2.1 PCR電泳結果

電泳后結果如圖1。

圖1 多重PCR擴增電泳圖

2.2 檢測結果

根據多重PCR方法對采集的樣本進行檢測，共計檢出胞內勞森菌陽性樣本36份，豬痢疾短螺旋體陽性樣本7份，大腸毛狀短螺旋體陽性樣本0份（表2），陽性率分別為14.2%，2.75%，0。在所有樣本中僅一份樣本中同時檢測到胞內勞森菌和豬痢疾短螺旋體陽性，存在混合感染情況，其他均為單一感染。在檢測的三種病原中胞內勞森菌檢出率最高，為14.2%；豬痢疾短螺旋體次之，為2.75%；大腸毛狀短螺旋體檢出率為0。對豬痢疾短螺旋體的檢測中，健康豬群中檢出率差別不大，均在5%左右，在屠宰場樣品中未檢測到；大腸毛狀短螺旋體在健康豬群和發(fā)病豬群中均未檢測到。

不同日齡的豬陽性率也不一樣，3～5周、6～8周、9～12周，大于13周的陽性率分別為15.4%、21.1%、34.1%、4.61%、14.2%，陽性率從最低的是13周齡后的豬，陽性率為4.61%，陽性率最高的是9-12周的豬，陽性率為34.1%，具體數據見表3。

表2 多重PCR檢測結果匯總

表3 不同日齡豬檢測結果

3 討論

（1）2014年冬至2015年春全國各地豬群中發(fā)生了較嚴重的傳染性腹瀉疾病，應用各種抗生素防治無效，其發(fā)病率與死亡率很高，造成了重大的經濟損失。其病因比較復雜，目前國內外對豬腹瀉病的研究比較集中3～5周齡以下豬群的病毒性及細菌性疾病，如傳染性胃腸炎、病毒性腹瀉、輪狀病毒、大腸桿菌、沙門氏菌等。豬痢疾短螺旋體、大腸毛狀短螺旋體和胞內勞森菌是引起3～5周齡以上（8～20周齡）豬群腹瀉病的關鍵的細菌性病原，國內對于這三種關鍵性病原在豬群中的感染情況及流行趨勢鮮有報道。針對上述情況，我們從2014年10月至2015年10月對上海地區(qū)豬群中的這三種病原的流行情況進行調查，以期獲得上海地區(qū)豬痢疾短螺旋體、大腸毛狀短螺旋體和胞內勞森菌感染情況的相關數據，為指導臨床防控提供參考信息。

（2）三種病原分離培養(yǎng)都有一定難度，豬痢疾短螺旋體和大腸毛狀短螺旋體為嚴格厭氧；胞內勞森菌微需氧，嚴格胞內寄生，只能在特定細胞上培養(yǎng)。利用分離培養(yǎng)方法對這三種病原進行鑒定周期長，效率低，成功率也低。目前比較常用的檢測方法是PCR和ELISA，有研究表明，PCR方法最為敏感。

（3）本實驗所采用的多重PCR方法能同時檢測豬痢疾短螺旋體、大腸毛狀短螺旋體和胞內勞森菌三種病原，可應用于豬腸道疾病的快速診斷。該方法做到了普通PCR需要做3次才能完成的檢測項目，不僅節(jié)省了大量的檢測時間和費用，而且具有一定的特異性和敏感性，適應于臨床腹瀉病流行病學的調查研究。

（4）多重PCR檢測結果顯示，在采集的254份糞便、回腸和肛門拭子中共檢測到7份豬痢疾短螺旋體陽性（陽性率為2.75%），33份胞內勞森菌陽性（陽性率為13.0%），大腸毛狀短螺旋體陽性數為0。豬痢疾短螺旋體在門診和規(guī)模化豬場的豬群中檢出率均在5～6%之間，在屠宰場樣本中檢出率為0，表明上海地區(qū)發(fā)病豬群中存在較低程度的感染，在健康豬群中基本沒有。檢測到的數據顯示大腸毛狀短螺旋體陽性率為0，但這并不代表上海地區(qū)不存在該菌感染，也應加強防范，預防為主。胞內勞森菌在散養(yǎng)戶豬場病例中檢出率最高，為28.8%，規(guī)?；i場中檢出率也有14.3%。表明上海地區(qū)豬群中普遍存在胞內勞森菌感染，但規(guī)?；i場帶菌率明顯低于散養(yǎng)戶豬場，這說明規(guī)范化的管理對于防治該病有一定積極意義。從屠宰場采集的外表健康的豬回腸中也檢測到6例帶菌豬，陽性率4.8%，表明部分屠宰豬感染胞內勞森菌后呈現隱性感染，這可能與抗生素的使用有關。由于當前國內抗生素使用非常普遍，在抗生素作用下未表現出明顯的腹瀉癥狀，也因此容易被人們所忽略。

（5）有報道顯示，豬群中胞內勞森菌血清學轉化常發(fā)生在8～10周齡[5]，這與母源抗體的保護性有關，在此階段失去母源抗體保護后可能增加其感染胞內勞森菌的風險。本研究與國外報道的胞內勞森菌感染年齡階段基本吻合，結果顯示9～12周齡豬感染率最高（34.1%），6～8周齡次之（21.1%），育成豬最低。

[1] 翁善鋼.豬痢疾短螺旋體病的診斷與防控[J].養(yǎng)豬，2015，（3）：92-95.

[2] 寇亞輝.豬痢疾短螺旋體的分離、鑒定與血清抗體ELISA檢測方法的建立[D]. 南京農業(yè)大學，2012.

張維誼（1979—），女，碩士，高級獸醫(yī)師，一直從事動物疫病的檢測，監(jiān)測、診斷、流行病學調查和相關科學的研究、技術推廣。