楊申明　王振吉　謝啟明

摘要：采用苯酚-硫酸法測定山銀花（Lonicera hypoglauca）多糖的含量，并對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交試驗，以山銀花多糖提取率為指標(biāo)，探討了提取次數(shù)、提取溫度、提取時間、料液比對山銀花多糖提取率的影響。結(jié)果表明，最佳提取工藝參數(shù)為提取4次、提取溫度80 ℃、提取時間150 min、料液比1∶20（g∶mL）。在此條件下，山銀花中多糖平均提取率為15.39%，加樣回收率為97.70%，該方法提取山銀花多糖操作簡便、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好，可作為山銀花多糖提取和含量測定的方法。

關(guān)鍵詞：山銀花（Lonicera hypoglauca）；多糖；苯酚-硫酸法；正交試驗

中圖分類號：S567.1+9；R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）10-2466-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.10.043

山銀花（Lonicera hypoglauca）別名大銀花、金因花（哈尼族名）、棒早瓜（苗族名），為忍冬科菰腺忍冬干燥的花蕾或帶初開的花[1]。它味甘、性寒，是臨床中常用中藥，藥用價值很高，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱的功效，常用于治療癰腫疔瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風(fēng)熱感冒、溫?zé)岚l(fā)病等。山銀花在中國資源豐富，分布于全國各省，它具有抗病原微生物、抗炎、抗氧化、保肝、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)與抗動脈粥樣硬化等方面的活性，在民間使用較為廣泛，是多種中成藥的主要原料。近年來，山銀花還被廣泛應(yīng)用于食品、飲料、保健品、化妝品和獸醫(yī)用等方面。據(jù)文獻(xiàn)報道，山銀花的化學(xué)成分主要有揮發(fā)油類、黃酮類、有機(jī)酸類和苷類等[2]。

多糖（Polysaccharide）是由許多相同或不同的單糖以糖苷鍵聚合而成的高分子化合物，它是自然界中儲量豐富的生物聚合物，主要包括植物多糖、動物多糖以及微生物多糖3類[3]。植物多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗病毒、抗衰老、抗疲勞以及抗凝血、抗炎、抗菌、抗驚厥、鎮(zhèn)靜、止喘及降血壓等[4-8]多種生物活性及藥理作用，很可能是山銀花免疫調(diào)節(jié)和抗癌抗腫瘤的有效成分之一。目前，有關(guān)山銀花多糖含量測定及提取工藝研究尚未見報道。試驗采用水提醇沉法對山銀花中多糖進(jìn)行提取，通過有關(guān)顯色反應(yīng)對提取物進(jìn)行定性鑒定，用苯酚-硫酸法測定其多糖含量，通過正交試驗對提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，旨在為山銀花的藥學(xué)價值研究提供參考并為其進(jìn)一步開發(fā)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山銀花采自云南省雙柏縣衰牢山，經(jīng)鑒定為忍冬科植物；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（≥98%）、石油醚（沸程30～60 ℃）、三氯乙酸、95%乙醇、苯酚、蒽酮、α-萘酚、濃硫酸等均為分析純。

722S型分光光度計（上海青華科技儀器有限公司）、HH-S2s型恒溫水浴鍋（金壇市大地自動化儀器廠）、電子天平（奧豪斯儀器）、12B5型臺秤（成都天平儀器廠）、SHZ-ⅢA型循環(huán)水真空泵（鞏義市英峪予華儀器廠）、遠(yuǎn)紅外快速恒溫干燥箱（鄄城威瑞科教儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗材料處理 樣品依次用自來水、去離子水洗凈風(fēng)干后放入遠(yuǎn)紅外快速恒溫（55 ℃）干燥箱中烘干，粉碎后過40目篩，得山銀花干粉。將山銀花干粉用折疊成筒狀的濾紙裝好置于索式提取器中，加入石油醚冷浸48 h，然后置于75 ℃水浴中，使其微沸回流反復(fù)提取，直至提取液澄清為止，取出冷卻至室溫。用減壓抽濾，濾渣用石油醚充分洗滌后，風(fēng)干至石油醚全部揮發(fā)，得到去除色素和油脂的山銀花，烘干后密封保存，備用。

1.2.2 山銀花多糖的提取 準(zhǔn)確稱取去除色素和油脂的山銀花干粉5.00 g，置于250 mL燒杯中，加入125 mL去離子水，置于80 ℃恒溫水浴鍋中加熱120 min后。減壓抽濾，濃縮濾液，往濾液中加入等體積的3%三氯乙酸除去山銀花中的蛋白質(zhì)，搖勻、靜置過夜，離心除去沉淀，再往濾液中加入4倍體積的95%乙醇沉淀多糖，靜置24 h，將醇沉后的白色絮狀物進(jìn)行離心，得山銀花多糖粗提物，用去離子水溶解多糖粗提物，得供試品溶液，備用。

1.2.3 山銀花多糖的鑒定 取2 mL供試品溶液3份，分別加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%苯酚溶液1 mL和硫酸溶液2 mL，濃度為2 g/mL蒽酮-硫酸溶液4 mL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5% α-萘酚溶液1 mL和濃硫酸溶液2 mL，進(jìn)行顯色反應(yīng)，觀察試驗現(xiàn)象，檢驗有無多糖[9，10]。

1.2.4 山銀花多糖含量測定

1）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備。準(zhǔn)確稱取105 ℃干燥至恒重的無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品100.00 mg，用去離子水溶解搖勻，并定容至100 mL容量瓶中，得濃度為1.00 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL，分別置于7個100 mL容量瓶中，用去離子水定容至刻度，再從上述容量瓶中分別移取4.0 mL溶液放入比色管中，再分別加入5%苯酚1.0 mL，濃硫酸5.0 mL，搖勻，置于35 ℃恒溫水浴鍋中加熱40 min，冷卻至室溫，以去離子水作空白對照，在490 nm波長處測吸光度，以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程[11]。

2）多糖提取率的計算。將所得山銀花多糖全部轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容至刻度，搖勻，再從100 mL容量瓶中移取1.0 mL溶液，置于100 mL容量瓶，加入去離子水定容，混均，再吸取4.0 mL已混勻的溶液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法測其吸光度。將所得吸光度代入線性回歸方程得到樣品稀釋后的濃度，將其值代入下式方程即可以求出多糖提取率：

多糖提取率=樣品溶液濃度×稀釋倍數(shù)×總體積/樣品質(zhì)量×100%

1.2.5 單因素試驗 按照上述提取方法，分別考察以下單因素的影響[12-14]：提取次數(shù)（1、2、3、4、5）、提取溫度（60、70、80、90、100 ℃）、提取時間（60、90、120、150、180 min）、料液比（g∶mL，下同）（1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35）。

1.2.6 正交試驗設(shè)計 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇提取次數(shù)、提取溫度、提取時間、料液比為試驗因素，每個因素取3個水平，以多糖提取率為評價指標(biāo)，設(shè)計L9（34）正交試驗研究最佳工藝條件。因素與水平見表1。根據(jù)正交試驗的結(jié)果，在最佳提取工藝參數(shù)條件下測定山銀花的精密度和加標(biāo)回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖的定性鑒定

顯色反應(yīng)結(jié)果見表2。由表2可知，山銀花中含有多糖類化合物。

2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。由圖1可知，葡萄糖濃度在0.0～35.0 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好，其回歸線方程為A=0.001 08+0.013 24C，R=0.999 78。

2.3 單因素試驗結(jié)果

提取次數(shù)對多糖提取率的影響見圖2a。由圖2a可知，開始時隨提取次數(shù)的增多，多糖的提取率增大，當(dāng)提取次數(shù)達(dá)3以后，多糖提取率變化不大，故試驗選擇提次數(shù)為2～4用于下一步優(yōu)化試驗。提取溫度對多糖提取率的影響見圖2b。由圖2b可知，開始時隨著提取溫度的升高，多糖的提取率升高，當(dāng)提取溫度升高到80 ℃時，提取率最高，之后隨提取溫度的增加，多糖提取率呈下降趨勢，故選擇提取溫度為70～90 ℃用于下一步優(yōu)化試驗。提取時間對多糖提取率的影響見圖2c。由圖2c可知，開始時隨著提取時間的延長，多糖的提取率升高，當(dāng)提取時間延長到120 min時，提取率最高，之后隨提取時間的延長，多糖提取率呈下降趨勢，故選擇提取時間為90～150 min用于下一步優(yōu)化試驗。料液比對多糖提取率的影響見圖2d。由圖2d可知，開始時隨溶劑的增加，多糖提取率升高，當(dāng)料液比為1∶25時提取率最高，之后隨著溶劑的進(jìn)一步的增加，多糖提取率呈下降趨勢，故選擇料液比為1∶20～1∶30用于下一步優(yōu)化試驗。

2.4 正交試驗結(jié)果

正交試驗結(jié)果見表3。由表3可知，各因素對山銀花多糖提取率的影響主次順序為：A>B>D>C，即提取次數(shù)>提取溫度>料液比>提取時間，最佳組合為A3B2C3D1，最佳提取工藝參數(shù)為提取4次、提取溫度80 ℃、提取時間150 min、料液比1∶20。在此條件下進(jìn)行重復(fù)性試驗，測得山銀花中多糖平均提取率為15.39%，RSD為0.27%（n=5），表明該方法重現(xiàn)性好。加標(biāo)回收率為97.70%，RSD為1.42%，表明該方法對山銀花多糖提取測量的準(zhǔn)確度較高。

3 小結(jié)與討論

由熱水法提取得到的粗多糖中常含有蛋白質(zhì)，常用的去蛋白質(zhì)方法有Sevag法、三氯乙酸沉淀法和蛋白酶水解法、鞣酸法等，本試驗采用三氯乙酸沉淀法去除山銀花多糖中的蛋白質(zhì)。采用苯酚-硫酸法測定多糖含量，為避免苯酚氧化，苯酚試劑要現(xiàn)用現(xiàn)配，由于硫酸密度比水大，容易分層，因此樣品加入苯酚試劑后和紫外測定前一定要振搖充分。

本研究結(jié)果表明，山銀花中富含多糖化合物，各因素對山銀花多糖提取率的影響程度不同，在趨于提取平衡的條件下，其影響的主次順序為提取次數(shù)>提取溫度>料液比>提取時間。優(yōu)化后的最佳提取工藝參數(shù)為提取4次、提取溫度80 ℃、提取時間150 min、料液比1∶20，在此條件下測得山銀花多糖平均提取率為15.39%，RSD為0.27%（n=5），加標(biāo)回收率為97.70%，該方法測定山銀花多糖含量，可獲得良好的線性關(guān)系（R=0.999 78），而且重現(xiàn)性試驗、回收率試驗均符合分析要求，方法準(zhǔn)確，可用于山銀花中多糖的提取和含量測定。

目前，對山銀花化學(xué)成分與藥理作用等方面研究相對較少，并且主要集中在綠原酸的研究方面， 對山銀花的其他活性成分及其藥理作用機(jī)理、臨床應(yīng)用等有待進(jìn)一步的研究探索。本試驗首次對山銀花多糖的測定方法和提取工藝參數(shù)進(jìn)行了初步研究，但山銀花多糖的組成、結(jié)構(gòu)、藥理藥效作用還需要更進(jìn)一步的研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] 云南省藥物研究所.云南天然藥物圖鑒.第五卷[M].昆明：云南科技出版社，2012.

[2] 粟時穎，鄭 興，廖端芳.山銀花研究進(jìn)展[J].南華大學(xué)學(xué)報，2009，37（6）：744-746.

[3] 唐 潔.植物多糖生物活性功能的研究進(jìn)展[J].食品研究與開發(fā)，2006，27（5）：130-132.

[4] 徐曉飛，蔣 麗，唐 健，等.植物多糖的保健功能及開發(fā)前景[J].中國食物與營養(yǎng)，2007（1）：48-50.

[5] 羅祖友，胡筱波，吳謀成.植物多糖的降血糖與降血脂作用[J].食品科學(xué)，2007，28（10）：596-600.

[6] 羅祖友，吳季勤，吳謀成.植物多糖的抗氧化與抗病毒活性[J].湖北民族學(xué)院學(xué)報（自然科學(xué)版），2007，25（1）：77-81.

[7] 彭會軍，鄒 群.植物多糖的生物活性研究進(jìn)展[J].西北藥學(xué)雜志，2008，23（6）：406-408.

[8] 韓江余，張光霽，石森林.植物多糖抗腫瘤研究近況[J].浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2008，32（2）：281-282.

[9] 馬美范.玫瑰花多糖的提取工藝[J].食品研究與開發(fā)，2009，30（12）：85-89.

[10] 鐘 巖，潘浦群，王艷紅，等.苯酚-硫酸法測定鮮人參中多糖含量[J].時珍國醫(yī)國藥，2008，19（8）：1957-1958.

[11] 王岸娜，吳立根.獼猴桃多糖提取工藝的研究[J].食品研究與開發(fā)，2008，29（2）：73-75.

[12] 谷威娜，肖 穎，王紅娟，等.柿葉多糖提取工藝的研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，49（8）：1953-1955.

[13] 王 勇，怕麗達(dá)·阿不力孜，米日古力，等.正交試驗法優(yōu)化阿里紅多糖的提取工藝[J].海峽藥學(xué)，2009，21（6）：36-38.

[14] 崔鳳杰，許泓瑜，舒 暢，等.響應(yīng)曲面法優(yōu)化灰樹花水溶性多糖提取工藝的研究[J].食品科學(xué)，2006，27（4）：142-147.