劉鼎++++++劉建生

[摘要] 目的 檢測Rab27A與Rab27B在3種人肝癌細胞系及1種永生化肝細胞系中的表達情況，初步研究Rab27A與Rab27B表達對肝癌細胞生物學特性的影響。 方法 采用RT-PCR及Western blot技術，檢測Rab27A與Rab27B mRNA在3種人肝癌癌細胞HepG2、Huh-7、Li-7及1種永生化肝細胞系HL-7702中的表達。 結果 Rab27A與Rab27B在肝癌細胞系及原發(fā)性肝癌組織中存在差異性表達。Rab27A mRNA在3種人肝癌細胞系中表達明顯強于1種人永生化肝細胞系；Rab27B mRNA在3種人肝癌及1種人永生化肝細胞系中均明顯表達但無顯著差異。 結論 Rab27A與Rab27B與原發(fā)性肝癌密切相關，可以為臨床采取合理診斷措施提供有效的參考依據(jù)。

[關鍵詞] Rab27A；Rab27B；肝細胞癌；RT-PCR；Western blot

[中圖分類號] R735 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2015）06（a）-0004-04

Expression of Rab27A and Rab27B in the four different hepatocellular carcinoma

LIU Ding LIU Jian-sheng▲

The First Clinical Medical College of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

[Abstract] Objective To investigate the expression of Rab27A and Rab27B in 3 human HCC lines and the immortalized hepatic cell line and its effect on biology characteristics of the cells. Methods The mRNA expression of Rab27A and Rab27B was detected by RT-PCR，and Western-blot in 3 human HCC lines of HepG2，Huh-7，Li-7 and the immortalized hepatic cell line of HL-7702. Results Rab27A and Rab27B were differentially expressed in cell lines and primary HCC tumors.The expression of Rab27A in 3 human HCC line was significantly better than that expressed in the immortalized hepatic cell line；the mRNA of Rab27B in 3 human HCC lines and the immortalized hepatic cell line were significantly expression but there was no significantly difference. Conclusion Rab27A and Rab27B expression are closely correlated HCC，it can provide the clinical reasonable diagnostic measures as valuable effective reference basis.

[Key words] Rab27A；Rab27B；Hepatocellular carcinoma；RT-PCR；Western blot

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，具有極高的侵襲性和轉移性，出現(xiàn)典型癥狀時，往往已經(jīng)為晚期。目前與HCC進展相關的因子包括癌胚抗原（CEA）、糖類抗原（CA199）、異常凝血酶原（DCP）等，同時Rab家族被證實與腫瘤密切相關。本文采用RT-PCR及Western blot技術檢測了Rab27A與Rab27B在3種人肝癌細胞系及1種永生化肝細胞系中的表達情況，以期進一步研究其對肝癌細胞生物學特性的影響，為原發(fā)性肝癌的研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

3種人肝癌細胞HepG2、Huh-7、Li-7及1種永生化肝細胞系HL-7702均采購自中國科學院上海生科院細胞資源中心，并按照其建議的方法進行培養(yǎng)。20%胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基、DMEM高糖培養(yǎng)液購自GIBCO公司，DEPC購自Sigma公司，ECL顯色試劑盒購自Thermo-fisher公司，NC膜購自Amersham公司，引物、Rab27A兔多抗、Rab27B羊多抗、HRP標記驢抗兔IgG、β-actin購自生工生物工程公司，Trizol、Taq PCR試劑盒購自TaKara公司，PCR反應儀采用Thermocycler（Biometra Germany公司），Alphaimager 2200分析儀（Alpha Innotech，San Leandro，CA公司），其他常規(guī)化學試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 各種細胞均按照標準方法進行培養(yǎng)，傳代時用2.5 g/L的胰蛋白酶消化， 按1∶3的比例傳代。取生長狀態(tài)良好、密度80%～90%的細胞用于實驗。

1.2.2 RT-PCR Rab27A基因引物F：5′-AACCGCCACAGTCTTCAATC-3′，R：5′-TCCCTGACCCTTCAAT-CAAC-3′；Rab27B基因引物F：5′-CCCTAAAAATCCCAGTCCATC-3′，R：5′-GAGCATCCCAGAGGAAACAC-3′。反應過程如下：94℃預變性2 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，最后72℃終延伸5 min，β-actin作為內參，擴增30個循環(huán)。PCR反應產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠成像系統(tǒng)分析結果。隨后對細胞系中的Rab27A與Rab27B mRNA的表達水平進行全定量PCR。

1.2.3 Western blot SDS-PAGE分離蛋白，每個樣品的上樣量為50 μg，電轉至NC膜。5%脫脂牛奶4℃封閉1 h，孵育一抗Rab27A（1∶1000稀釋）或Rab27B（1∶1200稀釋），4℃過夜。倒掉一抗溶液，用TBST漂洗液濾膜3次，每次10 min。加入相應種屬的辣根過氧化物酶標記的二抗溶液（1∶10 000稀釋），搖床上緩慢搖動，37℃ 2 h。倒掉二抗溶液，用TBST漂洗液濾膜3次，每次10 min。最后采用ECL試劑盒顯影，定影，觀察雜交信號。

1.3統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

通過采用RT-PCR、Western blot分析了3種人肝癌及1種人永生化肝細胞系中Rab27A及Rab27B mRNA及蛋白表達情況。β-actin內參條帶在205 bp處皆顯現(xiàn)明亮且無明顯差異，Rab27A mRNA在357 bp處3種人肝癌細胞系中明顯亮于1種人永生化肝細胞系；Rab27B mRNA在302 bp處均出現(xiàn)目的條帶，且條帶清晰；實驗重復3次。結果表明Rab27A mRNA在3種人肝癌細胞系中表達明顯強于1種人永生化肝細胞系；Rab27B mRNA在3種人肝癌及1種人永生化肝細胞系中均明顯表達但無顯著差異（圖1）。其中，β-actin作為內參。

A

3 討論

HCC是一種嚴重威脅人類生命的惡性腫瘤，發(fā)生率位居全球惡性腫瘤發(fā)病率第5位，死亡率位居全球惡性腫瘤發(fā)病率第3位，全球每年死于HCC患者人數(shù)高達69.6萬，其中超過50%的肝癌新發(fā)患者與死亡患者來自中國[1-2]。HCC的侵襲和轉移過程涉及到腫瘤細胞的增殖、黏附、遷移和侵襲等過程，而這一過程正是通過多種因子間的相互協(xié)調來實現(xiàn)。2013年諾貝爾生理學和醫(yī)學獎表彰詹姆斯·羅思曼等人發(fā)現(xiàn)細胞的囊泡運輸調控機制，表明細胞膜的分裂與囊泡運輸時細胞膜裂解是一致的。細胞的生命活動依賴于細胞內運輸體系的精細結構和控制結構，通過與目標細胞膜融合，在神經(jīng)細胞指令下可精確控制激素、生物酶、神經(jīng)遞質等分子傳遞的恰當時間與位置。RabGTP酶類作為機體內一組與內膜運輸相關的調節(jié)蛋白，可以作為囊泡運輸?shù)姆肿娱_關，與GTP結合則有活性，與GDP結合則無活性，通過與上游調控因子和下游特異效應因子相互作用，影響細胞的分泌、胞吞、信號轉導及發(fā)育，并可以控制膜結構的一致性和囊泡的形成、轉運、黏附、錨定、融合等過程，從而發(fā)揮重要的作用[3-4]。

人類Rab蛋白廣泛分布于各種生物細胞內不同的膜結構上，是小分子GTP結合蛋白家族中最大的亞家族，包括超過60個成員組成，可以通過不同的可變剪切形式而產(chǎn)生各種功能特異的亞型[5-6]。Rab家族可以通過特異性地定位于胞質中某些亞細胞器從而發(fā)揮特殊的功能，而抑制其中一些蛋白的表達，細胞膜的裂解次數(shù)可明顯減少[7]。Rab27亞家族包括Rab27A與Rab27B，兩者是具有71%同源性的小GTP 酶（20～29 kD），可以通過影響囊泡運輸物質來抑制機體免疫監(jiān)視功能，并為腫瘤細胞提供理想的生存環(huán)境，促進血管生成及腫瘤細胞增殖轉移[8]。Rab27A在人類染色體位點15q15-21.1，調節(jié)因子有3種：Rab親和蛋白，Slac2和Muncl3-4，功能主要為特異性地調節(jié)囊泡出胞過程，促進囊泡與細胞膜融合，并且激活溶酶體，促進細胞膜裂解[9]。Rab27A參與細胞色素顆粒的轉運，若表達缺失會導致色素沉著消失和黑素小體轉運功能缺陷，從而導致一種罕見的常染色體隱性遺傳性疾病——格里塞利綜合征（GS）[10-11]。Rab27A通過與Melanophilin和肌漿球蛋白Ⅴa共同形成一個三元復合體，參與粗細肌絲的滑行運動，因此有學者認為Rab27A具有肌球蛋白受體的全部或部分功能[12]。研究表明Rab27A可以通過調節(jié)VEGF、cyclin D1、IGF-2、MMP-9、MMP-7和p16蛋白的表達，從而在腫瘤細胞體內增殖、侵襲和轉移中發(fā)揮促進作用[13]。Rab27B位于18號染色體上，調節(jié)因子有3種：突出結合蛋白4（Slp4），Slac2b和Noc2，功能主要為參與大多數(shù)分泌性細胞的胞吐作用及運輸過程，促進囊泡物質由細胞質向細胞膜區(qū)域運動，在腦垂體、腮腺腺泡細胞、胰腺腺泡細胞的胞吐作用及血小板致密核心顆粒的分泌中有重要的調節(jié)作用[14-16]。有研究表明，抑制uPA和HGF的胞外水平的表達，HCC的侵襲和轉移能力均顯著下降。

近來研究發(fā)現(xiàn)，Rab27A與乳腺癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、神經(jīng)膠質瘤細胞等多種腫瘤細胞的侵襲和轉移密切相關；Rab27B表達于乳腺、肝臟、胃、大腸、脾、眼、心臟、腎臟等多種腫瘤細胞[16-20]。本實驗采用RT-PCR及Western blot技術，檢測Rab27A與Rab27B mRNA在3種人肝癌細胞HepG2、Huh-7、Li-7及1種永生化肝細胞系HL-7702中的表達，筆者發(fā)現(xiàn)，Rab27A與Rab27B在肝癌細胞系及原發(fā)性肝癌組織中存在差異性表達，Rab27A mRNA在3種人肝癌細胞系中表達明顯強于1種人永生化肝細胞系；Rab27B mRNA在3種人肝癌及1種人永生化肝細胞系中均明顯表達但無顯著差別。因此，根據(jù)上述實驗結果，Rab27A與Rab27B與HCC密切相關，可以為臨床采取合理診斷措施提供有效的參考依據(jù)。

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（收稿日期：2015-01-30 本文編輯：衛(wèi) 軻）