熊 煒，張 強(qiáng)，王 艷，陳政曉，蔣 靜，王巧全，陳 沁，李 健

（1.上海出入境檢驗(yàn)檢疫局，上海 浦東 200135；2.上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 寶山 200444）

犬冠狀病毒病是一種以胃腸炎為主要癥狀的高度接觸性傳染病，它由犬冠狀病毒（Canine coro?navirus，CCV）引起，臨床上以犬嚴(yán)重脫水、嘔吐、腹瀉和血便為主要特征，致死率較低，但與其他傳染病混合感染時(shí)，死亡率提高，對(duì)幼犬危害嚴(yán)重。目前，世界很多國(guó)家均已發(fā)現(xiàn)本病，是對(duì)養(yǎng)犬業(yè)危害較大的疫病之一。犬的健康與否與人類健康密切相關(guān)，以CCV為代表的冠狀病毒極易變異，導(dǎo)致冠狀病毒血清型眾多，且新的血清型還在不斷出現(xiàn)，為CCV的診斷和免疫預(yù)防帶來(lái)了更大的困難[1-2]。從1996年首次報(bào)道分離出CCV以來(lái)，國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)CCV的診斷方法和CCV主要蛋白的編碼基因進(jìn)行了廣泛的研究，已報(bào)道的主要檢測(cè)方法有病毒分離、RT-PCR和核酸探針檢測(cè)等[2-5]，已報(bào)道的CCV功能基因的克隆和序列分析主要有TN449株的M基因、V1株的膜蛋白基因、部分S基因等[6-9]。本研究對(duì)CCV TN449株的核衣殼蛋白（Nucleocapsid protein，N）基因編碼序列進(jìn)行克隆和表達(dá)，并將表達(dá)的CCV N蛋白包被ELI?SA反應(yīng)板，建立了CCV血清間接ELISA檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 病毒株及陽(yáng)性和陰性血清 CCV TN449株（ATCC編號(hào)：VR-989），由美國(guó)菌種保藏中心引進(jìn)并保存。將該病毒在狗直腸瘤細(xì)胞系（A72）上擴(kuò)增，取細(xì)胞裂解液備用。犬瘟熱病毒（CDV）、犬細(xì)小病毒（CPV）、犬副流感病毒（CPIV）、犬傳染性肝炎病毒（ICHV）、偽狂犬病病毒（PRV）和犬布魯菌（CB）的陽(yáng)性血清由本室保存。

1.2 主要試劑 TRIZol、逆轉(zhuǎn)錄酶，購(gòu)自Invitrogen公司；Taq酶，購(gòu)自Stratagene公司；RNA酶抑制劑、dNTP、DNA Marker、蛋白Marker、T4 DNA連接酶，購(gòu)自TaKaRa公司；限制性內(nèi)切酶BamH I和Not I，購(gòu)自NEB公司；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞（Top 10F和BL 21）、質(zhì)粒抽取試劑盒、膠回收試劑盒、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗犬IgG、TMB試劑，均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；蛋白表達(dá)產(chǎn)物純化采用GE公司HisTrap HP親和柱。

1.3 引物設(shè)計(jì) 參照GenBank中登錄的CCV TN449株的N基因序列（EF056485）設(shè)計(jì)引物，其上游引物（CCVNF）為：5′-CGGGGGCCAACCAGGGA CAACGCGTTAG-3′（BamH I），下游引物（CCVNR）為：5′-CCGGTTCGTTACCTCATCAATAATCTC-3′（Not I），擴(kuò)增N基因大小為1149 bp。

1.4 RNA抽提和目的基因擴(kuò)增 取200μL細(xì)胞裂解液進(jìn)行RNA抽提，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用PCR擴(kuò)增目的基因。

1.5 目的基因和質(zhì)粒載體的連接 PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒載體經(jīng)BamH I和Not I酶切，并經(jīng)膠回收純化后，使用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化Top 10F大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。

1.6 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳和Western Blot檢測(cè) 將IPTG誘導(dǎo)的重組菌樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)。將表達(dá)的重組蛋白利用HisTrap HP親和柱純化后，進(jìn)行蛋白電泳，并將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，再使用CCV陽(yáng)性血清和用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗犬IgG作為二抗，對(duì)重組蛋白進(jìn)行Western Blot鑒定。

1.7 抗原包被最佳濃度與血清最佳稀釋度的確定 采用方陣試驗(yàn)測(cè)定。取純化CCV N蛋白（濃度4.0 μg/mL），用磷酸鹽緩沖包被液，按1∶2～1∶128進(jìn)行稀釋，包被ELISA板，4℃過(guò)夜；用PBST洗滌后，加入40 g/L PEG20000，37℃封閉2 h；用PBST洗滌后，將CCV陽(yáng)性和陰性血清按1∶100～1∶800倍比稀釋后，加入酶標(biāo)板，37℃作用l h；用PBST洗滌后，加入1∶1000稀釋的羊抗犬HRPIgG，37℃作用1 h；用PBST洗滌后，加TMB顯色液，37℃作用15 min；最后加入H2SO4終止反應(yīng)，讀取OD450nm值。以陽(yáng)性血清OD450nm值接近1.0，P/N值（陽(yáng)性血清OD450nm/陰性血清OD450nm）≥2.0的抗原最大稀釋度作為抗原最適工作濃度，其相應(yīng)的血清稀釋度為最佳血清稀釋度。

1.8 間接ELISA陰陽(yáng)性臨界值的確定 采用建立的間接ELISA方法對(duì)本室保存的126份犬CCV陰性血清樣本進(jìn)行檢測(cè)。每份樣品重復(fù)3孔，結(jié)果取平均值，計(jì)算樣本OD450nm的平均值(-X)和標(biāo)準(zhǔn)差（SD）。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)，樣本OD450nm值＞陰性樣本OD450nm值+2SD時(shí)，判定為陽(yáng)性。

1.9 敏感性試驗(yàn) 將CCV陰性和陽(yáng)性血清做1∶50～1∶12800倍比稀釋后，用建立的間接ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.10 特異性試驗(yàn) 用建立的CCV間接ELISA方法分別檢測(cè)CDV、CPV、CPIV、ICHV、PRV和CB的陽(yáng)性血清，以驗(yàn)證建立的間接ELISA方法是否對(duì)其他犬傳染病的陽(yáng)性血清具有交叉反應(yīng)性。

1.11 臨床樣品的復(fù)檢試驗(yàn) 使用建立的CCV間接ELISA方法對(duì)本室保存的36份CCV陽(yáng)性犬血清和14份CCV陰性犬血清進(jìn)行復(fù)測(cè)，以驗(yàn)證建立的間接ELISA方法的穩(wěn)定性和可靠性。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的RT-PCR擴(kuò)增 將CCV TN449株在A72細(xì)胞上擴(kuò)增，后提取細(xì)胞培養(yǎng)物中的RNA，采用RT-PCR對(duì)CCV的N基因進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果顯示，擴(kuò)增的目的片段約1200 bp，與預(yù)期結(jié)果（1166 bp）（圖1）。

圖1 RT-PCR擴(kuò)增CCV N基因

2.2 目的基因的克隆及產(chǎn)物的酶切鑒定 將PCR產(chǎn)物膠回收后，與質(zhì)粒載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)平板篩選和酶切鑒定后，證實(shí)目的基因已重組入表達(dá)質(zhì)粒（圖2）。經(jīng)測(cè)序，質(zhì)粒中目的基因與報(bào)道的TN449株N基因（EF05648）同源性為98.6%。

圖2 CCV的N基因重組質(zhì)粒酶切鑒定

2.3 目的基因的表達(dá)及抗原性鑒定 將pETCCV-N1/BL 21重組菌進(jìn)行6 h誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，與空載體對(duì)照及未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)目的基因克隆菌的蛋白電泳圖相比，陽(yáng)性克隆菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，其電泳蛋白譜中出現(xiàn)了分子量大小為45 ku的目的基因表達(dá)產(chǎn)物（圖3）。將表達(dá)的目的蛋白產(chǎn)物經(jīng)SDSPAGE電泳、轉(zhuǎn)膜，并使用CCV陽(yáng)性血清進(jìn)行Western-Blot分析，證實(shí)電泳蛋白譜中出現(xiàn)的45 ku的蛋白具有CCV蛋白的反應(yīng)原性（圖4）。

圖3 CCV N基因表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳圖

2.4 抗原最佳包被濃度和最佳血清稀釋度的確定 經(jīng)方陣試驗(yàn)測(cè)定，建立的CCV間接ELISA檢測(cè)方法中，當(dāng)CCV陽(yáng)性血清為l∶100稀釋、CCV N蛋白抗原的最佳包被濃度為1.0μg/mL（稀釋倍數(shù)1∶4）時(shí)，陽(yáng)性血清的OD值接近于1.0，而陰性血清的OD值較低，分布于0.05～0.2之間，P/N值≥5.0。因此，確定CCV陽(yáng)性血清的最佳工作濃度為1∶100，相應(yīng)的CCV N蛋白抗原的最佳包被濃度為1.0μg/mL。

圖4 重組CCV N蛋白純化產(chǎn)物的Western-Blot分析

2.5 間接ELISA陰陽(yáng)性臨界值的確定 在確定抗原最佳包被濃度和最佳血清稀釋度的基礎(chǔ)上，采用建立的間接ELISA方法對(duì)本室收集和保存的126份犬CCV陰性血清樣本進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，這些血清的OD450值介于0.392至0.052間，其平均值為0.298，標(biāo)準(zhǔn)差SD為0.060，根據(jù)陰陽(yáng)性臨界值=+2SD得出該陰陽(yáng)性臨界值為0.418。因此，當(dāng)待測(cè)樣品的OD450nm值≥0.418時(shí)為陽(yáng)性，而OD450nm值＜0.418時(shí)為陰性。

2.6 間接ELISA敏感性試驗(yàn) 將純化的CCV N蛋白抗原按最佳濃度和條件包被96孔板，再將CCV陰性和陽(yáng)性血清分別做1∶50～1∶12800倍比稀釋后，加入96孔板進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)。結(jié)果顯示，CCV陽(yáng)性血清1∶6400稀釋后仍檢測(cè)呈陽(yáng)性，而經(jīng)1∶12800稀釋后檢測(cè)呈陰性。

表1 間接ELISA敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.7 間接ELISA特異性試驗(yàn) 用建立的CCV間接ELISA方法對(duì)CCV、犬瘟熱病毒、犬細(xì)小病毒、犬副流感病毒、犬傳染性肝炎病毒、偽狂犬病病毒和犬布魯菌的陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，CCV陽(yáng)性血清OD450值＞1.0，而其他病毒和細(xì)菌感染陽(yáng)性動(dòng)物的血清OD450nm值均＜0.418呈陰性，表明建立的間接ELISA方法具有良好的特異性。

2.8 臨床樣品的復(fù)檢試驗(yàn) 使用建立的CCV間接ELISA方法對(duì)本室保存的36份CCV陽(yáng)性犬血清和14份CCV陰性犬血清進(jìn)行復(fù)檢。結(jié)果顯示，36份CCV陽(yáng)性血清經(jīng)間接ELISA檢測(cè)均呈陽(yáng)性，而所有陰性血清經(jīng)復(fù)檢均呈陰性，陰陽(yáng)性符合率為100%。

3 討論

2004年肆虐全球的“非典”（Severe acute respi?ratory syndrome，SARS）是由一種新型冠狀病毒引起，它在世界上30多個(gè)國(guó)家不同程度的流行，導(dǎo)致了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。SARS病毒和CCV均來(lái)源于物種相近的犬貓科動(dòng)物，加強(qiáng)對(duì)CCV的研究和檢測(cè)意義重大。本研究以美國(guó)ATCC引進(jìn)的CCV參考毒株TN449株為對(duì)象，對(duì)其N蛋白編碼基因進(jìn)行克隆和表達(dá)，并證實(shí)該體外表達(dá)和純化的N蛋白具有良好的抗原反應(yīng)性；在獲取純化重組N蛋白基礎(chǔ)上，在其包被于ELISA反應(yīng)板，建立了CCV抗體間接ELISA檢測(cè)方法，并確定了重組蛋白的最佳包被濃度、待檢血清的最佳濃度和陰陽(yáng)性判定的臨界值。進(jìn)一步將該間接ELISA方法用于多種常見(jiàn)犬病陽(yáng)性血清的檢測(cè)，證實(shí)該方法具有良好的特異性；將該方法用于2006年至2012年本室收集并保存的36份CCV陽(yáng)性血清和14份陰性血清的復(fù)檢，證實(shí)建立的間接ELISA方法具有良好的穩(wěn)定性和可靠性，其陰陽(yáng)性結(jié)果符合率為100%。

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