張金龍

(上海交通大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，上海 200240)

0 引言

苯并吡喃類化合物被證明有多種生物活性和生理活性，由于其具有較低的細(xì)胞毒性以及良好的細(xì)胞膜穿透性，因此有成為理想的藥物模板化合物的特質(zhì)[1].該類化合物具有抗炎活性[2-3]，抗菌活性[4-5]，降血壓及降血糖作用[6-7]，擁有抗腫瘤的活性[8-10]，并是治療艾滋病的潛在藥物[11].

本課題組前期從紅樹林來(lái)源的廈門鏈霉菌318菌株[12]中分離得到一種苯并吡喃類化合物，并將其命名為廈門霉素[13-14].該化合物已被申請(qǐng)專利[15]，指出其具有抑制ICAM-1(細(xì)胞間黏附分子-1)/LFA-1(淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1)介導(dǎo)的細(xì)胞黏附作用.本實(shí)驗(yàn)室也對(duì)廈門霉素的立體絕對(duì)構(gòu)型進(jìn)行了解析[13]，并對(duì)其生物學(xué)功能進(jìn)行了研究，證實(shí)廈門霉素有抑制纖維化的多種生物效應(yīng).例如在體外抑制肺過(guò)度纖維化、通過(guò)抑制局部炎癥來(lái)弱化肥胖性疤痕以及減弱機(jī)械應(yīng)力的作用[13-14].因此它可能成為抗纖維化作用的潛在藥物.以上表明，廈門霉素可以作為合成藥物的前體，因此廈門霉素的大量制備具有深遠(yuǎn)意義.但廈門霉素在廈門鏈霉菌318菌株中產(chǎn)量較少，且發(fā)酵周期長(zhǎng)，難以滿足工業(yè)生產(chǎn)的需要.如何實(shí)現(xiàn)廈門霉素的高效表達(dá)，已成為研究的必然趨勢(shì).

本課題組已克隆得到廈門霉素基因簇[16](共5個(gè)基因：ximA、ximB、ximC、ximD和ximE)，將其整合到異源表達(dá)質(zhì)粒pSET152中，并命名為pLMO09404[16].吸水鏈霉菌FR-008發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)80年代初，是一株抗生素產(chǎn)生菌[17]，該菌株發(fā)酵時(shí)間短(只需3 d左右)，具有適用于多種抗生素的工業(yè)化生產(chǎn)的潛質(zhì)[18]，且遺傳背景較為清晰[19-25].白色鏈霉菌可以產(chǎn)各種色素及抗生素，已經(jīng)被用于工業(yè)化生產(chǎn)的研究中[26-27].本研究中，將質(zhì)粒pLMO09404分別與吸水鏈霉菌FR-008及白色鏈霉菌進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移，檢測(cè)廈門霉素是否能在白色鏈霉菌及吸水鏈霉菌FR-008中表達(dá).

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

所用菌株、質(zhì)粒及引物見(jiàn)表1.

表1 菌株、質(zhì)粒和引物信息Tab. 1 Information of strain, plasmid and primer

1.1.2 培養(yǎng)基和抗生素

大腸桿菌培養(yǎng)基為L(zhǎng)B，鏈霉菌種子液培養(yǎng)基為TSB培養(yǎng)基[28]，孢子懸浮液[28]用于孢子離心后重新懸浮孢子的培養(yǎng)基，2×孢子萌發(fā)液[28]為大腸桿菌-鏈霉菌接合轉(zhuǎn)移的培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基為GYM培養(yǎng)基[28]，氨芐青霉素使用終質(zhì)量濃度為100 mg/L，阿泊拉霉素(Apramacin,Apr)使用終質(zhì)量濃度為50 mg/L，氯霉素萘(Chloramphenicol,Chl)使用終質(zhì)量濃度為12.5 mg/L，卡那霉素(kanamycin,Kan)使用質(zhì)量濃度為12.5 mg/L，啶酮酸使用質(zhì)量濃度為25 mg/L.

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

高效液相色譜儀為Agilent 1200；質(zhì)譜儀，Waters ACQUITYTM UPLC & Q-TOF MS Premier；紫外分析儀，Beckman公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 質(zhì)粒及鏈霉菌基因組DNA的提取

大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備和質(zhì)粒DNA提取、轉(zhuǎn)化等操作參見(jiàn)文獻(xiàn)[29].鏈霉菌培養(yǎng)、鏈霉菌孢子制備及鏈霉菌基因組DNA提取操作步驟參見(jiàn)文獻(xiàn)[28].

1.2.2 大腸桿菌和吸水鏈霉菌FR-008，白色鏈霉菌之間的接合轉(zhuǎn)移

將質(zhì)粒pLMO09404及質(zhì)粒pSET152分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌ET12567(pUZ8002)中，得到2個(gè)供體菌株大腸桿菌ET12567(pUZ 8002/ pLM009404)和大腸桿菌ET12567(pUZ 8002/ pSET152).將轉(zhuǎn)化后的兩株大腸桿菌分別接種于50 mL 新鮮的LB培養(yǎng)基(加入質(zhì)量濃度為 50 mg/L 阿泊拉霉素、25 mg/L 卡那霉素及12.5 mg/L氯霉素)中，37 ℃，220 r/min，培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6，分別離心收集菌體沉淀，用LB培養(yǎng)基洗滌2次，最后將菌體分別懸浮于1.5 mL LB培養(yǎng)基中待用. 取鏈霉菌FR-008，白色鏈霉菌孢子懸液100 μL，離心收集孢子沉淀，懸浮于5 mL0.05 mol/L、pH 8.0 的TES 緩沖液中，50 ℃熱激10 min，迅速冷卻至室溫，加等體積2×孢子萌發(fā)液，37 ℃，220 r/min，培養(yǎng)2 h，離心收集孢子沉淀，重懸于200 μL LB培養(yǎng)基中.各取200 μL大腸桿菌ET12567(pUZ8002/ pSET152)和大腸桿菌ET12567(pUZ 8002/ pLM009404)分別與孢子懸浮液混合涂布于SFM固體培養(yǎng)基上，28 ℃靜止培養(yǎng)18 h后用1 mL 含阿泊拉霉素和萘啶酮酸的水覆蓋，繼續(xù)培養(yǎng)2～3 d后長(zhǎng)出接合子.

1.2.3 PCR驗(yàn)證條件

PCR反應(yīng)參數(shù)：95 ℃變性5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min ，72 ℃ 1 min ，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min.

1.2.4 白色鏈霉菌及吸水鏈霉菌FR-008發(fā)酵條件

將鏈霉菌孢子懸液接種到SFM固體培養(yǎng)基中，28 ℃靜止培養(yǎng)4 d；挑取單菌落，接種到TSB液體培養(yǎng)基(含阿泊拉霉素)中， 28 ℃，220 r/min，培養(yǎng)2 d作為種子液.按10%接種量將TSB種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基GYM中，28 ℃，220 r/min，培養(yǎng)3 d，收集發(fā)酵液待測(cè).

1.2.5 色譜檢測(cè)條件

色譜柱為Agilent 1200 Eclipse XDB-C18(4.6 × 150 mm，5 μm)，柱溫26 ℃，流動(dòng)相為A 和B兩相梯度洗脫，A：乙腈，B： 1‰甲酸水.洗脫程序: 0～8 min，A為15%～60%；8～19 min，A為60 %；19～23 min，A為60%～85%；23～30 min，A為85%；30～32 min，A為85%～15%；32～36 min，A為15%.流速0.5 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，進(jìn)樣量為10 μL.

1.2.6 質(zhì)譜檢測(cè)條件

源溫度115 ℃，去溶劑化溫度350 ℃，錐形氣體流量50 L/h，脫溶劑氣體流量600 L/h，毛細(xì)管電壓 3 000 V.

2 結(jié)果與討論

2.1 PCR驗(yàn)證接合轉(zhuǎn)移

將質(zhì)粒pLMO09404和質(zhì)粒pSET152分別導(dǎo)入吸水鏈霉菌FR-008及白色鏈霉菌得到S.albus-152,S.albus-09404,S.hygroscopicusFR008- 152以及S.hygroscopicusFR008-09404共4株菌株.用廈門霉素基因簇中的一個(gè)基因ximC的引物及質(zhì)粒pSET152的引物用PCR方法分別檢測(cè)S.xiamenensis318,S.albus,S.albus-152,S.albus-09404,S.hygroscopicusFR-008,S.hygroscopicusFR008-152以及S.hygroscopicusFR008-09404共7株菌株,見(jiàn)圖1，其中基因ximC的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為821 bp，質(zhì)粒pSET152的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為301 bp.結(jié)果表明在S.albus,S.albus-152,S.hygroscopicusFR-008以及S.hygroscopicusFR008-152中檢測(cè)不到基因ximC，說(shuō)明在S.albus,S.albus-152,S.hygroscopicusFR-008以及S.hygroscopicusFR008-152中不存在廈門霉素基因簇；在S.albus-152,S.hygroscopicus和S.hygroscopicusFR008-152中可以檢測(cè)到質(zhì)粒pSET152的存在，表明質(zhì)粒pSET152已經(jīng)接合轉(zhuǎn)移入到S.albus-152和S.hygroscopicusFR008-152中.由于質(zhì)粒pLMO09404是由質(zhì)粒pSET152和廈門霉素基因簇整合而成，所以若菌株中有質(zhì)粒pLMO09404，則基因ximC的引物及質(zhì)粒pSET152的引物用PCR方法都可檢測(cè)到，結(jié)果在S.albus-09404,以及S.hygroscopicusFR008-09404可以檢測(cè)到基因ximC和pSET152，表明質(zhì)粒pLMO09404已經(jīng)接合轉(zhuǎn)移入到S.albus-09404,以及S.hygroscopicusFR008-09404中.在S.xiamenensis318中可以檢測(cè)到基因ximC，說(shuō)明在S.xiamenensis318中有廈門霉素基因簇.

圖1 PCR檢測(cè)7個(gè)菌株Fig. 1 The identification of the 7 strains by PCR

注： 泳道1： pSET152引物，泳道2：ximC基因引物，泳道3：Marker，A:S.hygroscopicusFR008-09404；B:S.hygroscopicusFR008-152；C:S.hygroscopicusFR-008；D:S.albus-09404；E:S.albus-152；F:S.albus；G:S.xiamenensis318 Marker 為Thermo Scientific GeneRuler 1 kb DNA Ladder

2.2 HPLC驗(yàn)證異源表達(dá)

將S.xiamenensis318、S.albus、S.albus-152、S.albus-09404、S.hygroscopicusFR-008、S.hygroscopicusFR008-152及S.hygroscopicusFR008-09404共7株菌株發(fā)酵，取發(fā)酵液進(jìn)行HPLC檢測(cè).在S.xiamenensis318可以在保留時(shí)間16 min時(shí)檢測(cè)到廈門霉素,見(jiàn)圖2 A，其在254 nm的紫外吸收?qǐng)D譜見(jiàn)圖2 A.S.hygroscopicusFR-008和S.hygroscopicusFR008-152在保留時(shí)間16 min時(shí)沒(méi)有峰出現(xiàn),見(jiàn)圖3，S.hygroscopicusFR008-09404在保留時(shí)間16 min時(shí)檢測(cè)到廈門霉素,見(jiàn)圖2 C，其在254 nm的紫外吸收?qǐng)D譜見(jiàn)圖2 C,結(jié)果初步表明廈門霉素基因簇在S.hygroscopicusFR-008得到表達(dá).S.albus和S.albus-152在保留時(shí)間16 min時(shí)沒(méi)有峰出現(xiàn),見(jiàn)圖3，S.albus-09404在保留時(shí)間16 min時(shí)檢測(cè)到廈門霉素,見(jiàn)圖2 B，其在254 nm的紫外吸收?qǐng)D譜如圖2 B，結(jié)果初步表明廈門霉素基因簇在S.albus-09404得到表達(dá).

注: A)廈門霉素; B)S.hygroscopicusFR008-09404異源表達(dá)產(chǎn)物; C)S.albus-09404異源表達(dá)產(chǎn)物.

圖2廈門霉素的紫外吸收?qǐng)D譜
Fig.2TheUVAbsorbanceofthemiamenmycin

圖3 HPLC檢測(cè)4個(gè)菌株的發(fā)酵液Fig.3 The identification of the 4 strains fermented liquid by HPLC

2.3 質(zhì)譜驗(yàn)證異源表達(dá)

將廈門霉素、S.hygroscopicusFR008-09404異源表達(dá)產(chǎn)物和S.albus-09404異源表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè).結(jié)果發(fā)現(xiàn)S.hygroscopicusFR008-09404異源表達(dá)產(chǎn)物和S.albus-09404異源表達(dá)產(chǎn)物的質(zhì)譜圖與廈門霉素的質(zhì)譜圖是一致的,結(jié)果見(jiàn)圖4.質(zhì)譜表明廈門霉素在白色鏈霉菌及吸水鏈霉菌FR-008中表達(dá)成功.

注: A)廈門霉素的質(zhì)譜圖; B)吸水鏈霉菌FR008-09404表達(dá)的廈門霉素的質(zhì)譜圖; C)S. albus-09404表達(dá)的廈門霉素的質(zhì)譜圖.

3 結(jié)論

廈門霉素可以作為抑制炎癥和抗纖維化藥物的潛在藥物，它在野生株的發(fā)酵液少量存在，但無(wú)論是從發(fā)酵液里直接提取還是通過(guò)化學(xué)反應(yīng)直接產(chǎn)生廈門霉素都存在成本高、不適合生產(chǎn)的問(wèn)題.在廈門霉素的生物合成基因簇被探明后，就有可能通過(guò)基因改造的方法讓菌株直接生產(chǎn)大量的廈門霉素實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化.本研究成功將廈門霉素的生物合成基因簇在可作為工業(yè)發(fā)酵的底盤菌株白色鏈霉菌及吸水鏈霉菌FR-008進(jìn)行異源表達(dá)，在理論上為研究廈門霉素的生物合成機(jī)制及調(diào)控提供便利條件，并為進(jìn)一步的遺傳改造生產(chǎn)高附加值的苯并吡喃類化合物奠定了基礎(chǔ).

廈門霉素可在吸水鏈霉菌FR008-09404及白色鏈霉菌中表達(dá)，其中在吸水鏈霉菌FR008-09404的產(chǎn)量與野生株S.xiamenensis318中的產(chǎn)量相當(dāng)，而在白色鏈霉菌中的產(chǎn)量較少，這可能是由于培養(yǎng)菌株都是在GYM培養(yǎng)基中發(fā)酵，其培養(yǎng)條件也相同，但GYM培養(yǎng)基及發(fā)酵條件可能并不是吸水鏈霉菌FR008-09404和白色鏈霉菌產(chǎn)廈門霉素的最優(yōu)培養(yǎng)基及發(fā)酵條件，以后可以通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件來(lái)提高產(chǎn)量.在S.hygroscopicusFR008-09404及S.albus-09404的發(fā)酵液中HPLC檢測(cè)到其野生株和對(duì)照菌株S.hygroscopicusFR008、S.albus、S.hygroscopicusFR008-152和S.albus-152中沒(méi)有的產(chǎn)物，可為以后分離新的苯并吡喃類化合物奠定基礎(chǔ).