周 佩，張曼寧，張 瑤，劉 颯，李勝天*

(上海交通大學(xué) a.Bio-X研究院；b.生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，上海 200240)

0 引言

癲癇(epilepsy)是常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，表現(xiàn)為腦內(nèi)神經(jīng)元高度同步化異常放電所引起的短暫腦功能失調(diào)綜合征，其特征是反復(fù)發(fā)作.根據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，全球大約有5千萬人遭受癲癇的折磨[1].目前治療癲癇的主要方法是采用抗癇藥物治療，但是仍有1/3的患者在使用抗癇藥物治療后不能有效控制發(fā)作，稱為耐藥性癲癇[2].因此，研究更有效的癲癇治療方法是非常重要和迫切的.近年來的研究開始關(guān)注癲癇發(fā)作間期的高頻震蕩(high frequency oscillations，HFOs)[3]，發(fā)作間期HFOs出現(xiàn)的數(shù)量可以鏡像反映癲癇發(fā)作程度，在臨床應(yīng)用上有可能作為一種有效生物標(biāo)志物[4].HFOs分類兩種類型：ripples(80～250 Hz)和fast ripples(250～500 Hz).Lin等發(fā)現(xiàn)讓癲癇患者連續(xù)6個(gè)月每天聆聽8 min莫扎特K.448能夠降低癲癇樣放電活性[5].隨后他們進(jìn)一步應(yīng)用先天性自發(fā)癲癇模型鼠研究莫扎特K.448音樂治療的作用，用，發(fā)現(xiàn)給予莫扎特K.448治療后模型鼠發(fā)作頻率和癇性放電程度降低[6].但是，音樂治療對HFOs的作用尚無研究報(bào)告.本研究采用廣泛應(yīng)用的耐藥性癲癇模型——匹羅卡品(pilocarpine, PILO)誘導(dǎo)的顳葉癲癇動(dòng)物模型，在其慢性自發(fā)發(fā)作期(spontaneous recurrent seizure，SRS)給予莫扎特K.448音樂治療，測試其對HFOs的影響.

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6 ～ 7周齡健康、普通清潔級C57BL/6 雄性小鼠，體重為20 ± 2 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購買后飼養(yǎng)在獨(dú)立通風(fēng)籠盒系統(tǒng)中適應(yīng)環(huán)境2周，飼養(yǎng)房內(nèi)白熾燈自動(dòng)定時(shí)開關(guān)保證晝夜時(shí)間各12 h(00:00—12:00為白天，12:00—24:00為黑夜).

1.2 主要試劑和儀器設(shè)備

阿托品(atropine)、PILO均為美國Sigma公司；驚跳反射系統(tǒng)，美國，San Diego，SR-LABTM；Neurolog電生理記錄系統(tǒng)，英國，CED，NL900D；模擬-數(shù)字轉(zhuǎn)換器，英國，CED，1401 plus.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 建立癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticus，SE)模型

將23只小鼠隨機(jī)分為兩組：實(shí)驗(yàn)組15只，對照組8只.實(shí)驗(yàn)組先給予1 mg/kg 阿托品預(yù)處理，以降低PILO引起的外周膽堿能效應(yīng)，減少動(dòng)物死亡.同時(shí)，對照組腹腔也注射同劑量的阿托品.30 min后，實(shí)驗(yàn)組腹腔注射匹羅卡品(PILO，300 mg/kg)，對照組注射等容量生理鹽水.PILO處理后引起小鼠癇性發(fā)作級別根據(jù)Racine分級[7]的標(biāo)準(zhǔn)判定，見表1.SE標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定為：給予PILO處理后1 h內(nèi)發(fā)作級別達(dá)到4級以上并且累積發(fā)作時(shí)間超過30 min.小鼠達(dá)到SE標(biāo)準(zhǔn)即給予水合氯醛(150 mg/kg)腹腔注射終止發(fā)作.對照組也給予同劑量水合氯醛處理.

表1 Racine典型分級標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Racine’s classification

1.3.2 埋置電極

在SE后3周，利用腦立體定位儀對造模成功小鼠和對照組小鼠進(jìn)行顱骨內(nèi)埋置電極手術(shù).在前囟后1.8 mm、左側(cè)旁開1.4 mm處為記錄電極位置；前囟前1.5 mm、右側(cè)旁開1.5 mm處為參考電極位置.術(shù)后恢復(fù)1周即開始記錄腦電(electroencephalogram，EEG).

1.3.3 聽覺驚跳反射(acoustic startle response)實(shí)驗(yàn)

在SE后4周對小鼠(SE模型組8只，對照組8只)進(jìn)行驚跳反射實(shí)驗(yàn).將小鼠放入SR-LAB驚跳反射系統(tǒng)，適應(yīng)5 min后，選用不同分貝的白噪音(0、70、80、90、100、110 dB)偽隨機(jī)進(jìn)行刺激，每個(gè)刺激給予10次，每次持續(xù)20 ms，2次聲音刺激之間偽隨機(jī)間隔5 ～ 15 ms.

1.3.4 音樂治療實(shí)驗(yàn)

在SE后6～7周，對以上進(jìn)行驚跳反射實(shí)驗(yàn)的所有小鼠播放莫扎特D大調(diào)雙鋼琴奏鳴曲K.448.播放時(shí)間在小鼠的夜間活躍期(17點(diǎn)至19點(diǎn))，音樂時(shí)長24 min，每天連續(xù)播放2 h，聲音強(qiáng)度為80 dB.每只小鼠連續(xù)接受2次音樂治療.采用視頻腦電檢測系統(tǒng)在音樂刺激前記錄3 h EEG，刺激中和刺激后分別記錄2 h EEG.EEG測試使用Neurolog系統(tǒng)，采樣率設(shè)置為2.5 kHz，濾波范圍為0.1～500 Hz.

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 PILO腹腔注射成功誘發(fā)SE

PILO是乙酰膽堿能受體的激動(dòng)劑.由于膽堿能受體廣泛分布于心肌、竇房結(jié)、血管、白細(xì)胞和血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞上，因此PILO能夠強(qiáng)有力地影響外周器官、血管和血細(xì)胞循環(huán)，產(chǎn)生外周膽堿能效應(yīng)及引起血腦屏障破壞，導(dǎo)致腦內(nèi)神經(jīng)元同步化異常放電，引起發(fā)作[8].本實(shí)驗(yàn)中15只小鼠腹腔注射PILO，成功誘發(fā)SE并存活的小鼠有8只，成功率為53.3 %;未達(dá)到SE并存活的有4只，死亡3只，死亡率為20.0 %.對照組所有小鼠中未出現(xiàn)癇性發(fā)作.

2.2 SRS期EEG活性異常

從SRS期EEG數(shù)據(jù)(0.1～500 Hz)中截取了發(fā)作間歇期對應(yīng)的EEG，采用低頻濾波和高頻濾波處理的方法(FIR digital filtering)，對小鼠發(fā)作間歇期不同頻率的EEG活性特征進(jìn)行分析.低頻濾波為10 Hz-傳統(tǒng)概念上與癇性發(fā)作密切相關(guān)的震蕩頻率；高頻濾波為50～80 Hz(γ活性)、ripples(80～250 Hz)和fast ripples(250～500 Hz).結(jié)果顯示在發(fā)作間歇期高頻(γ活性和ripples)范圍內(nèi)EEG活性異常，見圖1.

2.3 SE模型小鼠的聽力未受明顯影響

驚跳反射是機(jī)體在響應(yīng)突發(fā)性刺激時(shí)產(chǎn)生的一種復(fù)雜性反應(yīng).在驚跳反射實(shí)驗(yàn)研究中，最常用的誘發(fā)刺激為白噪聲引起的驚跳反射[9].隨機(jī)給予聲音刺激的分貝越高，小鼠受到驚嚇后腳底對儀器底座產(chǎn)生的壓力越大，因此根據(jù)輸出的相對壓力值大小可判斷小鼠的聽力是否受到影響.結(jié)果顯示：SE模型組與對照組相比，在不同分貝聲音刺激時(shí)小鼠所產(chǎn)生的相對壓力之間沒有顯差，表明兩組小鼠對聲音強(qiáng)度的敏感性相似(表2).

a：0.1～500 Hz；b：0.1～10 Hz；c：50～80 Hz；d：80～200 Hz；e：250～500 Hz.箭頭表示濾波后不同頻段EEG上與a圖相對應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)，圓圈表示γ活性和高頻振蕩的腦電特征.

表2 不同分貝白噪音刺激時(shí)對儀器底座產(chǎn)生的相對壓力值Tab.2 Pressure index induced by different white noises

2.4 莫扎特K.448對SRS期EEG活性的影響

通過對比分析SE模型組與對照組小鼠在音樂治療前后功率能量的變化，發(fā)現(xiàn)音樂治療后兩組小鼠的EEG功率均在55～145 Hz范圍內(nèi)顯著升高(F55～95 Hz= 136.387、F105～115 Hz= 26.690、F130～145 Hz= 41.201，P<0.001)，說明γ活性和ripple活性在音樂刺激后增強(qiáng)(圖2、圖3、圖4).但是音樂刺激和分組之間的交互作用沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P> 0.05).由于儀器本身電噪音(50 Hz或60 Hz倍數(shù))的影響，在50、100、120、150 Hz附近部分頻率受到大的干擾，因此去除了相應(yīng)的功率譜數(shù)據(jù).因?yàn)檩敵鼋Y(jié)果較多，本文省略沒有顯著差異的頻率范圍的功率譜數(shù)據(jù).

a. 不同分組之間功率譜能量的變化；b. 不同頻率之間功率譜能量的變化.圖2 55～95 Hz范圍內(nèi)刺激前后功率譜能量的變化Fig.2 The change of EEG power in 55～95 Hz

a. 不同分組之間功率譜能量的變化；b. 不同頻率之間功率譜能量的變化.圖3 105～115 Hz范圍內(nèi)刺激前后功率譜能量的變化Fig.3 The change of EEG power in 105～115 Hz

a. 不同分組之間功率譜能量的變化；b. 不同頻率之間功率譜能量的變化.圖4 130～145 Hz范圍內(nèi)刺激前后功率譜能量的變化Fig.4 The change of EEG power in 130～145 Hz

3 討論

3.1 HFOs與癲癇

癲癇是一種具有神經(jīng)元異常同步化放電現(xiàn)象的復(fù)雜性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，近年來許多研究表明HFOs有可能是癲癇的一種生物標(biāo)記物[10].1999年，Bragin等人在顳葉癲癇患者和癲癇模型動(dòng)物上檢測到HFOs，認(rèn)為這些HFOs是由病理網(wǎng)絡(luò)互聯(lián)的神經(jīng)元產(chǎn)生強(qiáng)大的超同步放電引起的[11].在PILO誘導(dǎo)的顳葉癲癇動(dòng)物模型研究中發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生自發(fā)發(fā)作的腦區(qū)與HFOs活性緊密相關(guān)，發(fā)作起始區(qū)域內(nèi)HFOs出現(xiàn)的比率越高，其產(chǎn)生癲癇發(fā)作的可能性越高[12].HFOs常與發(fā)作間期癇性放電(interictal epileptiform discharge)同時(shí)出現(xiàn)，并且發(fā)作間期HFOs能夠響應(yīng)抗癇藥物的藥量變化.抗癇藥物減量后，發(fā)作間期HFOs與癲癇發(fā)作頻率同時(shí)增加[4].移除產(chǎn)生HFOs的腦組織有較好的手術(shù)治療效果，表明HFOs有潛在的臨床意義，有可能發(fā)展為新的臨床治療靶點(diǎn)[13].本研究采用PILO誘導(dǎo)的SE模型模擬人類顳葉癲癇，在模型鼠SRS間歇期檢測到HFOs，表明了SE模型后小鼠HFOs的EEG活性異?？勺鳛镻ILO模型小鼠的癲癇活動(dòng)指標(biāo)之一.

3.2 音樂治療與癲癇

音樂是人們?nèi)粘Ｉ町?dāng)中的一部分，對于大多數(shù)人來說，音樂能夠帶來歡樂，美好的音樂可以調(diào)節(jié)情感，提升生活品質(zhì).音樂對大腦功能起著重要作用，比如能夠提升語言記憶能力、改善認(rèn)知功能[14].在很多神經(jīng)系統(tǒng)疾病包括帕金森、阿爾茨海默病研究中都發(fā)現(xiàn)音樂對患者的治療有幫助[15-17].“莫扎特效應(yīng)”一詞源于1993年Rauscher等人的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)研究：給正常測試者聽10 min莫扎特K.448，測試者表現(xiàn)出空間推理能力顯著提高[18].隨后，一些研究者發(fā)現(xiàn)莫扎特K.448能夠降低大部分癲癇患者癲癇樣放電的頻率，說明莫扎特K.448可能有助于癲癇的治療.但是以上研究中的癲癇患者是在不改變抗癇藥物治療的情況下接受莫扎特K.448音樂治療的，癲癇樣放電活性的降低是音樂本身造成還是其與抗癇藥物交互作用的結(jié)果并不清楚[5,19].本研究發(fā)現(xiàn)，在SE模型小鼠SRS期，連續(xù)2d 給予2 h的莫扎特K.448音樂治療后， SE模型組和對照組的EEG功率在55 ～ 145 Hz范圍內(nèi)都顯著升高，說明莫扎特K.448能夠增強(qiáng)了腦內(nèi)神經(jīng)元同步化放電.但是功率譜能量的升高與小鼠是否經(jīng)過PILO處理無關(guān)，這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明莫扎特K.448的短期治療對正常小鼠以及PILO模型小鼠可引起同樣的EEG功率譜增強(qiáng)，而不是減弱.

4 結(jié)論

通過建立顳葉癲癇動(dòng)物模型，首次在不給予抗癲藥物治療的前提下檢測了莫扎特K.448對癇性放電活性的影響.結(jié)果表明，短時(shí)期給予莫扎特K.448音樂治療沒有降低癇性放電程度，反而增強(qiáng)了高頻EEG活性.今后將對長時(shí)程音樂治療對SE模型小鼠SRS期EEG的影響做進(jìn)一步的研究，探索更為有效的治療方法，幫助癲癇患者緩解疾病帶來的痛苦，可能在癲癇治療中有新的突破.