范露，劉茹，熊善柏，*

（1.華中農業(yè)大學食品科技學院，湖北武漢430070；2.華中農業(yè)大學楚天學院食品與生物科技學院，湖北武漢430205；3.國家大宗淡水魚加工技術研發(fā)分中心（武漢），湖北武漢430070）

魚蛋白肽鈣的分級及肽與鈣的結合性能研究

范露1，2，劉茹1，3，熊善柏1，3，*

（1.華中農業(yè)大學食品科技學院，湖北武漢430070；2.華中農業(yè)大學楚天學院食品與生物科技學院，湖北武漢430205；3.國家大宗淡水魚加工技術研發(fā)分中心（武漢），湖北武漢430070）

以白鰱采肉后的魚骨為原料制備魚蛋白肽鈣，用無水乙醇分級分離得到6個級分：水不溶性級分CA、50%、60%、70%、80%、90%乙醇不溶性級分CB、CC、CD、CE、CF，采用紅外分析法和葡聚糖凝膠色譜法等手段比較了各級分間的差異。結果表明：各級分中均含有一定量的肽和鈣，6個級分可以歸為3類：CA得率最高，水溶性最差，鈣通過化學鍵與分子量較大的肽結合；CB、CC相似，得率最低，鈣通過化學鍵與小肽或氨基酸結合；而CD、CE和CF三者相似，水溶性好，鈣呈游離態(tài)，通過物理吸附作用與魚蛋白肽結合。

魚蛋白肽鈣；分級；結合性能；紅外分析法；葡聚糖凝膠色譜法

鈣是人體中含量最多的礦質元素，具有構成骨骼和牙齒、維持神經肌肉正常活動、參與凝血等多項功能，對人體非常重要，而我國膳食結構以素食為主，含鈣少，吸收差，因此補鈣非常必要，通過改善膳食結構增加乳類攝入可以增加鈣的攝入，但必要時必須通過鈣制劑來補充機體鈣質。

鈣制劑經歷了無機鈣、有機酸鈣和螯合鈣3個階段，氨基酸螯合鈣和蛋白肽螯合鈣以其穩(wěn)定性好、吸收率高等特點備受關注[1]。氨基酸螯合鈣研究較多，關于制備、結構鑒定、特性及應用等均有不少報道[2-4]。蛋白肽螯合鈣多是以富含蛋白的原料通過水解制取多肽，再與鈣鹽反應制得螯合鈣。而以蛋白水解產物為原料制備螯合物時，蛋白水解物本身就是一個復雜的體系，因此鈣與肽的結合可能存在多種方式。楊燊[5]、夏松養(yǎng)[6]等采用酶水解南海低值魚蛋白制備多肽復合物并制得多肽-鈣螯合物，通過紅外光譜分析推測鈣離子與羧基以共價鍵的方式結合，并采用0%、50%和80%的乙醇對產物進行分級，結果表明未經乙醇沉淀的級分抗氧化活性最強；祝德義[7]研究了酶法水解動物皮制得的膠原多肽與Ca2+的結合行為，通過紫外光譜、紅外光譜、掃描電鏡等手段對結合產物進行初步表征，表明膠原多肽和Ca2+有一定的結合能力，且結合反應比較復雜，既有配位結合，又有離子鍵結合，還有吸附作用；Bao等[8]采用透析、凝膠色譜及紅外對大豆水解液和鈣離子生成的可溶性多肽鈣進行研究，發(fā)現分子量在14.4 KDa和8 KDa～9 KDa的多肽與鈣離子的結合能力最強，且鈣與多肽的結合能力與羧基基團的含量線性相關。Jung等[9]在pH2.2醋酸環(huán)境下用胃蛋白酶水解魚骨架，采用超濾和親和色譜法分離出與鈣離子親和力最高的多肽，通過串聯(lián)質譜儀分析得到與鈣螯合程度最高的小肽分子序列，其與鈣的結合能力與酪蛋白磷酸肽相當。

魚骨是魚糜制品加工中產生的主要下腳料，就常用的鰱魚而言，在加工過程中魚骨約占魚體總重的10%，魚頭和魚骨一起達到了40%[10]，占整個下腳料的2/3[11]。魚骨中不僅含有大量的鈣磷，還含有豐富的蛋白質，將魚骨加工制備魚蛋白肽鈣制劑可大大提高其附加值。本研究通過對魚蛋白肽鈣不同級分之間的比較，探尋各級分間的差異，為進一步研究其性質和應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白鰱購于華中農業(yè)大學集貿市場；復合蛋白酶（6.49萬U/g）：諾維信天津公司生產；其他化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

HH-6型數顯恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；DHG-9240A型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司；DJ550-A型絞肉機：沈陽市廚房設備廠；Avanti J-26型高速離心機：美國貝克曼公司；UV-2600型紫外可見分光光度計：Unico；NEXUS 470 FTIR型紅外光譜儀：美國Nicolet公司。

1.3 方法

1.3.1 魚蛋白肽鈣的制備及分級

采用不同濃度乙醇梯度沉淀將反應產物分為6個級分。反應結束后，于5 000 r/min離心10 min，所得沉淀記為CA，上清液繼續(xù)補充加入無水乙醇至體系乙醇濃度50%，于5 000 r/min離心10 min，所得沉淀記為CB，依次往前一次離心上清液中加入無水乙醇，使體系乙醇濃度分別達到60%、70%、80%、90%，離心所得沉淀依次為CC、CD、CE和CF。CA～CF各級分質量占合成產物總質量的比例即為該級分相對得率。反應前的魚蛋白肽記為C0。

1.3.2 肽含量的測定

微量凱氏定氮法[12]。

1.3.3 鈣含量的測定

GB/T－6436-2002 EDTA絡合滴定法。

1.3.4 溶解率的測定

參考胡莉莉的方法[13]。

1.3.5 紅外光譜分析

將樣品于105℃烘干后與KBr在遠紅外快速干燥器下于瑪瑙研缽中研細混勻，壓片，在NEXUS-470型傅立葉變換紅外光譜儀進行紅外掃描。掃描范圍4 000cm-1-400cm-1，儀器分辨率4cm-1，掃描次數32次。

1.3.6 肽鈣分布測定

將樣品配制成10 mg/mL的溶液，經0.45 μm的微孔濾膜過濾，用Sephadex G-25凝膠過濾層析，收集洗脫液，檢測每管樣品在280 nm下的吸光值，同時用1.3.3法測定每管中的鈣含量，并以每次洗脫收集到的第1管的鈣含量為基準，后續(xù)每管中的鈣含量與第1管鈣含量的比值即為鈣相對含量。層析條件：上樣量3 mL，洗脫液為0.02%迭氮化鈉-0.9%氯化鈉溶液，采用部分收集器收集，4.8 mL/管，6管/h。

1.3.7 數據處理

采用SAS和Excel軟件進行處理。

2 結果與分析

試驗所制備的魚蛋白肽鈣各級分經50℃烘干后均呈淡黃色晶體狀，無異味，其中級分CD、CE和CF易吸潮結塊。

2.1 魚蛋白肽鈣的基本組成

魚蛋白肽鈣分級后各級分的相對得率如表1所示。

表1 魚蛋白肽鈣各級分肽和鈣含量（n=3，平均值±標準差）Table 1Content of peptide and calcium for every components（n=3，means±SD）

由表1可知，產物中級分CA所占比例最大，CD、CE和CF次之，級分CB和CC最少。在魚蛋白肽鈣分級過程中，未加乙醇時水不溶性成分沉淀下來，得到級分CA；實驗過程中發(fā)現，乙醇濃度由0%增加到40%時，所沉淀產物極少，當乙醇濃度達50%時，部分產物被分離出來，即級分CB；乙醇濃度繼續(xù)提高至60%時，此階段獲得的產物CC很少，所占比例最小；繼續(xù)增大乙醇濃度至70%、80%、90%，醇不溶性成分逐漸被沉淀。

各級分的肽含量、鈣含量及肽鈣比例亦有差異。級分CA、CB、CC的肽含量較低，鈣含量較高，肽鈣比例?。患壏諧D、CE、CF肽含量較高，鈣含量較低，肽鈣比例較大。

2.2 魚蛋白肽鈣的溶解性

溶解性是鈣制劑的一項重要質量指標。魚蛋白肽鈣各級分溶解率結果如圖1所示。

圖1 魚蛋白肽鈣各級分溶解率（n=3）Fig.1 Ratio of dissolution for every components（n=3）

由圖1可知，級分CA溶解性最差，級分CE和CF溶解性最好，在pH2、pH7和pH10中均幾乎完全溶解。在分級過程中，隨著體系乙醇濃度的增大，水溶性差的產物先沉淀，水溶性好的產物后沉淀，因此各級分溶解率隨沉淀時所用乙醇濃度的增大而增大。此外，級分CA和CB的溶解率受pH影響較大。

2.3 魚蛋白肽鈣的紅外光譜分析

圖2是魚蛋白肽和反應后魚蛋白肽鈣各級分紅外光譜圖。

圖2 魚蛋白肽鈣各級分紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectroscopy spectra of every components

反應前的魚蛋白肽（C0）的譜圖中位于3 300 cm-1吸收峰為蛋白質的N-H伸縮振動引起；位于1 660 cm-1吸收峰是由C=O伸縮振動引起，屬于酰胺Ⅰ帶；1590cm-1吸收峰為N-H面內彎曲產生，屬于酰胺Ⅱ帶，但部分為酰胺Ⅰ帶所掩蓋；1 410 cm-1伯酰胺C-N伸縮振動吸收峰，也稱為酰胺Ⅲ帶[7，14-16]。

與魚蛋白肽C0相比，魚蛋白肽鈣各級分與之差異大小不一，從CA、CB、CC、CD、CE至CF，各級分與C0的差異逐漸縮小。加入Ca2+后，3 300 cm-1的N-H伸縮振動峰均有所加強；酰胺I帶由1 660 cm-1紅移至1 500 cm-1～1 400 cm-1不等；另外1 100 cm-1左右較弱的鋸齒形吸收峰強度增大，CA最為明顯，變?yōu)橐还饣瑥姺?，此峰?NH2的面內搖擺振動，同時900 m-1左右的一個小吸收峰在CA、CB、CC中較明顯，為N-H的面外彎曲振動，證明了CA中Ca2+與魚蛋白肽結合緊密，其次是CB和CC。級分CD、CE和CF的紅外圖譜的峰形及峰強度與魚蛋白肽C0較相似，推測其中鈣與肽的相互作用可能比較微弱。

2.4 魚蛋白肽鈣的肽鈣分布

魚蛋白肽鈣的肽鈣分布結果見圖3。

由圖3肽鈣分布圖可知，根據肽與鈣的相對出峰位置，6個級分的肽鈣分布可歸為3類：第一類是級分CA[圖3（c）]，該級分中鈣的分布明顯不同于游離鈣[圖3（a）]，峰形尖而窄，出峰時間稍早于游離鈣，且其尖峰恰好與肽的第一個峰重合，說明該級分中鈣與大分子量肽段緊密結合，印證了紅外分析結果；第二類包括CB[圖3（d）]和CC[圖3（e）]兩個級分，該級分的鈣出峰時間較晚，鈣的峰值在肽的峰值之后，可能是鈣與小肽或氨基酸結合在一起，而這些小肽或氨基酸在280 nm處并無吸收；第三類包括級分CD[圖3（f）]、CE [圖3（g）]和CF[圖3（h）]，這3個級分中雖然鈣峰與肽峰部分重疊，但其中鈣的峰形和出峰時間與游離鈣[圖3（a）]很相近，推斷其中的鈣與肽或氨基酸未形成化學鍵，而是以游離態(tài)存在，鈣僅通過物理吸附作用

圖3 魚蛋白肽鈣各級分肽鈣分布圖Fig.3 Peptide and calcium distribution of every components

而聚集在肽周圍，結合力較弱，在凝膠色譜中二者分離開來，因此高濃度的乙醇沉淀下來的產物可能是肽和游離鈣的混合物，這恰好解釋了CD、CE和CF 3個級分的紅外圖譜與未經反應的魚蛋白肽相差不大的原因。

3 結論

采用無水乙醇對魚蛋白肽鈣進行分級可獲得CA、CB、CC、CD、CE和CF 6個級分，通過對各級分的相對得率、基本組成、水溶性、紅外光譜分析和肽鈣分布等的比較，發(fā)現各級分中均含有一定量的肽和鈣，6個級分可歸為3類：水不溶性的CA得率最高，水溶性最差，鈣通過化學鍵與分子量較大的肽緊密結合；不溶于50%和60%乙醇的CB、CC相似，得率最低，鈣通過化學鍵與小肽或氨基酸緊密結合；而不溶于70%、80%和90%乙醇的CD、CE和CF三者相似，水溶性好，鈣呈游離態(tài)，通過物理吸附與魚蛋白肽結合。本研究可為蛋白肽鈣的分離和純化提供依據。

[1]李翠芹,何臘平,仇保權．氨基酸螯合鈣的研究進展[J]．食品研究與開發(fā),2011,32(10):162-164

[2]郭艷．水解米渣蛋白及制備氨基酸螯合鈣的工藝研究[D]．成都:四川大學,2006

[3]朱迎春．畜禽骨的綜合利用及復合氨基酸螯合鈣的開發(fā)研制[D]．太原:山西農業(yè)大學,2005

[4]白建,朱迎春,梁銳萍,等．新型氨基酸螯合鈣的研制[J]．畜牧獸醫(yī)科技信息,2005(11):75-76

[5]楊燊,鄧尚貴,秦小明．低值魚蛋白多肽－鈣螯合物的制備和抗氧化、抗菌活性研究[J]．食品科學,2008,29(1):202-206

[6]夏松養(yǎng),謝超,霍建聰,等．魚蛋白酶水解物的鈣螯合修飾及其功能活性[J]．水產學報,2008,32(3):471-477

[7]祝德義,李彥春,靳麗強,等．膠原多肽與鈣結合性能的研究[J]．中國皮革,2005,34(3):26-29

[8]Bao X L,Lv Y,Yang B C,et al.A study of the soluble complexes formed during clacium binding by soy-bean protein hydrolysates[J]. Food Chemistry,2008(10):1750-3841

[9]Won-Kyo Jung,Se-Kwon Kim.Calcium-binding peptide derived from pepsinolytic hydrolysates of hoki(Johnius belengerii)frame[J]. European Food Research and Technology,2007,224(6):763-767

[10]王建中,鄧仁芳,朱瑞龍,等．淡水魚魚頭與魚骨的利用[J]．食品科學,1994(2):47-50

[11]龔鋼明,顧慧,蔡寶國．魚類加工下腳料的資源化與利用途徑[J]．中國資源綜合利用,2003(7):23-24

[12]張水華．食品分析[M]．北京:中國輕工業(yè)出版社,2004:68-71

[13]胡莉莉,張正茂,郭蕾,等．球磨條件對水溶性大米淀粉理化特性的影響[J]．食品科技,2007(8):94-97

[14]周元臻,魏永鋒,張維平．殼聚糖-Ca(II)配位聚合物的合成及其性能表征[J]．食品科學,2003,24(1):36-39

[15]謝晶曦,常俊標,王緒明．紅外光譜在有機化學和藥物化學中的應用(修正版)[M]．北京:科學出版社,2001:298-321

[16]吳瑾光．近代傅里葉變換紅外光譜技術及應用(下卷)[M]．北京:科學技術文獻出版社,1993:193-201

Studies on Classification of Fish Protein Peptides-calcium and Combination between Peptide and Calcium

FAN Lu1，2，LIU Ru1，3，XIONG Shan-bai1，3，*
（1.College of Food Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，Hubei，China；2.College of Food and Biology Science and Technology，Chutian College，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430205，Hubei，China；3.National R＆D Branch Center For Conventional Freshwater Fish Processing（Wuhan），Wuhan 430070，Hubei，China）

Fish protein peptides-calcium was prepared from silver carp bone.It was divided into six components：deposit after reaction component CA，deposit in 50%，60%，70%，80%and 90%alcohol solution called CB，CC，CD，CE and CF，respectively.Meanwhile，the differences of the components were inspected with the method of IR and Sephadex.Both peptide and calcium existed in every components.And the six components can be cataloged as three kinds.The CA possessed highest yield and the poorest water-soluble capacity.Ca2+was combined with polypeptide by chemical bond in CA.The yield of CB and CC was the lowest. Ca2+was combined with micromolecular peptide or amino acid by chemical bond in CB and CC.The other components（CD，CE and CF）possessed the highest water-soluble capacity.Ca2+existed in free state or was combined with peptide by physical adsorption.

fish protein peptides-calcium；classification；combination；infrared spectroscopy；sephadex chromatography

2013-12-24

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.02.002

現代農業(yè)產業(yè)技術體系建設專項資金（CARS-46-23）

范露（1982—），女（漢），講師，碩士，研究方向：食品大分子提取及應用。

*通信作者：熊善柏（1963—），男（漢），教授，碩士，研究方向：水產品加工及貯藏工程。