宋爽　劉宇　許峰　王守現(xiàn)　王蘭青　黃晨陽

摘要：通過搖瓶抑菌試驗，研究了二氧化氯消毒劑稀釋液對食用菌細菌性褐斑病病原菌托拉斯假單胞桿菌（Pseudomonas tolaasii）的防治效果。試驗結(jié)果表明，15 000 mg/L二氧化氯消毒劑40 000倍液對3株托拉斯假單胞桿菌的抑制率均在95%以上，對平菇、金針菇、雙孢蘑菇、香菇、杏鮑菇等食用菌菌絲生長無影響。

關(guān)鍵詞：二氧化氯消毒劑；褐斑病；托拉斯假單胞桿菌；抑菌試驗；食用菌

中圖分類號：S436.46+1 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）07-0114-02

細菌性褐斑病是一類在食用菌生產(chǎn)上普遍發(fā)生且危害嚴重的病害，在平菇、雙孢蘑菇、香菇、杏鮑菇、金針菇等多種食用菌上時常發(fā)生，尤其對平菇和雙孢蘑菇危害最為嚴重，發(fā)生率可以達到80%以上[1]。食用菌感染該病害后菌蓋表面出現(xiàn)黃褐色或深褐色的斑點，子實體失去食用價值，對食用菌生產(chǎn)造成嚴重損失[2]。細菌性褐斑病的病原菌是托拉斯假單胞桿菌（Pseudomonas tolaasii），由其產(chǎn)生的托拉斯毒素作用于食用菌，使子實體產(chǎn)生病斑[3]。

目前生產(chǎn)上用于防治細菌性褐斑病的化學藥劑主要有漂白粉、農(nóng)用鏈霉素等，但在實際防治過程中，效果不是十分理想。二氧化氯消毒劑是一種廣譜消毒劑，對細菌、真菌、病毒等病原微生物有很高的殺滅作用[4]。由于二氧化氯消毒劑具有高效低毒低殘留的特點，在食用菌生產(chǎn)上常用來對接種室、培養(yǎng)室、出菇房進行空間熏蒸消毒，也用于出菇房噴霧，用來防治食用菌雜菌和病害。本試驗開展二氧化氯消毒劑稀釋液對食用菌細菌性褐斑病病原菌托拉斯假單胞桿菌的抑制效果研究，為食用菌細菌性褐斑病防治提供科學依據(jù)。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試藥劑 二氧化氯消毒劑由北京必潔仕環(huán)保新技術(shù)開發(fā)有限責任公司生產(chǎn)。

1.1.2 供試菌株和食用菌 試驗中的3種供試托拉斯假單胞桿菌菌株：菌株JCM21583購自日本菌保中心；菌株JZB2120021、JZB2120022于2013年10月分離自糙皮側(cè)耳的子實體，根據(jù)細菌形態(tài)特征、培養(yǎng)性狀、16S rDNA、gyrB、rpoB基因序列分析，鑒定為托拉斯假單胞桿菌。平菇雙抗黑平、金針菇白金一號、雙孢蘑菇As2796、香菇承德L18、杏鮑菇13號由本課題組保藏。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：含10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、10 g氯化鈉，加蒸餾水定容至1 000 mL，用于托拉斯假單胞桿菌的培養(yǎng)。綜合PDA培養(yǎng)基：含200 g馬鈴薯、20 g葡萄糖、20 g瓊脂、3 g KH2PO4、1.5 g MgSO4、5 g蛋白胨、10 mg維生素B1，加蒸餾水定容至1 000 mL，用于食用菌菌絲培養(yǎng)。

1.2 試驗方法

1.2.1 搖瓶抑菌試驗 細菌培養(yǎng)：在50 mL三角瓶中裝入10 mL液體LB培養(yǎng)基，分別接入100 μL D660 nm值為0.8的3種托拉斯假單胞桿菌菌液。

藥劑處理：在LB培養(yǎng)基中接入添加不同濃度的二氧化氯消毒劑稀釋液的托拉斯假單胞桿菌菌液。二氧化氯消毒劑利用0.22 μm無菌濾膜過濾后，用無菌水進行各濃度稀釋，設(shè)置稀釋2 500、5 000、10 000、20 000、40 000、80 000、160 000和320 000倍液8種濃度處理，每個濃度設(shè)3次重復，每個重復設(shè)4瓶?？瞻讓φ占尤氲攘繜o菌水。

抑菌結(jié)果測定：各濃度處理在160 r/min、25 ℃搖床中振蕩培養(yǎng)12 h后，利用分光光度計測定細菌菌體密度值，測定條件為：1倍光強、660 nm波長。

1.2.2 二氧化氯消毒劑對食用菌菌絲生長的影響 藥劑處理：PDA培養(yǎng)基冷卻后加入二氧化氯消毒劑40 000倍液，充分混勻后倒平皿，空白對照加入等量無菌水倒平皿。

食用菌菌絲培養(yǎng)：在添加二氧化氯消毒劑稀釋液的PDA培養(yǎng)基平皿上培養(yǎng)各品種食用菌。利用打孔器將供試各菌株定量接種在PDA培養(yǎng)基平皿的中心點，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，記錄菌絲生長狀況。每個食用菌品種設(shè)3次重復，每個重復設(shè)3皿。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Duncans新復極差法分析不同濃度二氧化氯消毒劑處理對3種病原菌防治效果和對食用菌菌絲生長影響的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 搖瓶抑菌試驗

搖瓶抑菌試驗結(jié)果（表1）表明，二氧化氯消毒劑對食用菌褐斑病病原菌托拉斯假單胞桿菌有明顯的抑制作用。在較低稀釋倍數(shù)下（≤40 000倍），二氧化氯消毒劑對供試的3種托拉斯假單胞桿菌的抑制率均在95%以上；稀釋倍數(shù)為 80 000 倍時，抑制率均在90%以上。對菌株JZB2120021來說，2 500～80 000倍稀釋液間的抑制率差異不顯著，而與 16 000、32 000 倍液的抑制率差異達到極顯著水平；對菌株JZB2120022來說，2 500～40 000倍稀釋液間的抑制率差異不顯著，而與80 000、16 000和32 000倍液的抑制率差異均達到極顯著水平；二氧化氯消毒劑對菌株JCM21583的抑制效果最好，2 500～40 000倍液對其完全抑制。綜合以上試驗數(shù)據(jù)，使用40 000～80 000倍的二氧化氯消毒劑稀釋液可以有效地抑制細菌性褐斑病病原菌，抑制率在90%以上。

2.2 二氧化氯消毒劑對食用菌菌絲生長的影響

在搖瓶抑菌試驗的基礎(chǔ)上，選取了二氧化氯消毒劑 40 000 倍液添加到PDA培養(yǎng)基中，研究該劑量消毒劑對食用菌菌絲生長的影響。從表2可以看出，二氧化氯消毒劑 40 000 倍液對5種食用菌菌絲生長沒有產(chǎn)生影響。用 Duncans 新復極差法對試驗結(jié)果進行分析，消毒劑添加組與對照組的菌絲生長速度差異在0.05、0.01水平上均不顯著。

3 結(jié)論與 討論

褐斑病在全國各食用菌主產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，以春秋季節(jié)最為嚴重，且病害一旦發(fā)生就會大面積感染，不易防治。除化學防治之外，還有其他防治方法。趙肖靜等利用褐斑病弱致病力菌株篩選得到一株抗病效果好的平菇誘抗菌株，誘導抗病效果為66.73%[5]；Fermor等分離了多株托拉斯假單胞桿菌

二氧化氯消毒劑作為一種新型環(huán)保型消毒劑，在對食用菌接種場地和出菇房的消毒上具有很好的效果。近幾年，一些學者也對二氧化氯消毒劑抑制食用菌競爭性雜菌和病害方面進行了研究。黃金寶等發(fā)現(xiàn)必潔仕二氧化氯消毒劑對食用菌雜菌如毛霉菌、木霉菌與鏈孢霉菌等有非常理想的防治效果，并且用該消毒劑拌料，對平菇菌絲體萌發(fā)與生長有很好的促進作用[7-8]；張濤濤等在平菇發(fā)生褐斑病后用二氧化氯消毒劑4 000倍液進行噴霧，可有效地控制褐斑病的蔓延[9]。本研究明確了二氧化氯消毒劑對褐斑病病原菌托拉斯假單胞桿菌最低抑制濃度，40 000～80 000倍液即可有效地抑制褐斑病病原菌，抑制率在90%以上，為食用菌生產(chǎn)的安全用藥提供了據(jù)支持。

參考文獻：

[1]張瑞穎，胡丹丹，左雪梅，等. 平菇和雙孢蘑菇細菌性褐斑病研究進展[J]. 植物保護學報，2007，34（5）：549-554.

[2]孫 婕，肖 揚，邊銀丙. 平菇褐斑病和軟腐病發(fā)生規(guī)律初步調(diào)查[J]. 中國食用菌，2011，30（4）：66，68.

[3]Rainey P B，Brodey C L，Johnstone K. Identification of a gene cluster encoding three high-molecular-weight proteins，which is required for synthesis of tolaasin by the mushroom pathogen Pseudomonas tolaasii[J]. Molecular Microbiology，1993，8（4）：643-652.

[4]劉 南，熊鴻燕. 二氧化氯消毒研究進展[J]. 重慶醫(yī)學，2005，34（3）：449-451.

[5]趙肖靜，石延霞，謝學文，等. 平菇細菌性褐斑病誘抗菌株篩選及誘抗效果[J]. 食用菌學報，2013，20（1）：96-100.

[6]Fermor T R，Lynch J M. Bacterial blotch disease of the cultivated mushroom Agaricus bisporus：screening，isolation and characterization of bacteria antagonistic to the pathogen（Pseudomonas tolaasii）[J]. Journal of Applied Bacteriology，1988，65（3）：179-187.

[7]黃金寶，林秀敏，陳文良，等. 必潔仕牌復方消毒劑防治雜菌的效果試驗[J]. 食用菌，2006，28（2）：49-51.

[8]黃金寶，陳文良，張濤濤，等. 必潔仕牌消毒劑對食用菌及雜菌生長的影響[J]. 中國食用菌，2008，27（5）：49-51.

[9]張濤濤，董 丹，劉偉成，等. 必潔仕牌消毒劑防治平菇黃斑病藥效試驗[J]. 中國食用菌，2011，30（1）：70-71.