張安強(qiáng)王小臣王星麗瞿 亮孫培龍*馬 新

（1.浙江工業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院，杭州 310014；2.杭州百山祖生物科技有限公司，杭州 310052）

冬蟲夏草多糖抗氧化活性及其單糖組成的研究

張安強(qiáng)1王小臣1王星麗2瞿 亮2孫培龍1*馬 新1

（1.浙江工業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院，杭州 310014；2.杭州百山祖生物科技有限公司，杭州 310052）

利用超聲輔助提取法和分級醇沉得到3種醇沉組分粗多糖CSP40、CSP60和CSP80，并分析這3種組分的抗氧化活性?；钚暂^好的粗多糖CSP40經(jīng)過DEAE-Sepharose Fast Flow離子柱層析和Sephacryl S-400凝膠柱層析純化得到單一組分CSP40-2a，進(jìn)行乙?；幚砗笥肎C-MS測得其單糖組成。結(jié)果表明，超聲輔助提取所得的3個醇沉組分均具有較好的抗氧化活性，從強(qiáng)到弱依次為 CSP40＞CSP80＞CSP60。乙?；治霰砻?，CSP40-2a主要由3種單糖組成，分別是D-甘露糖、D-葡萄糖和D-半乳糖，其摩爾比為1.98︰1.0︰0.67。

冬蟲夏草；多糖；抗氧化活性；多糖純化；單糖組成

多糖是生物體內(nèi)重要的大分子活性化合物，與維持生物機(jī)能密不可分[1]。近年來，諸多研究表明，真菌多糖具有抗氧化、降血糖、降血脂、抗腫瘤、抗炎癥等生物活性，同時對機(jī)體溫和無害[2]。因此，真菌多糖正逐漸成為功能性食品和新藥開發(fā)的重要研究方向之一。

冬蟲夏草[Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc]為麥角菌科（Clavicipiraceace）蟲草屬（Cordyceps）的傳統(tǒng)食藥用菌[3]，主要生長于青藏高原、云貴高原等海拔3 500米以上的高山草甸土中。蟲草含有豐富的生物活性物質(zhì)，具有極高的營養(yǎng)價值和獨特的藥用價值[4]。但因其特殊的寄生習(xí)性和嚴(yán)苛的生長環(huán)境，野生蟲草資源十分稀少，市場價格非常昂貴?，F(xiàn)階段工業(yè)上多采取發(fā)酵法獲取冬蟲夏草菌絲體作為相關(guān)產(chǎn)品生產(chǎn)的原料[5]。但大多數(shù)產(chǎn)品均為冬蟲夏草菌絲體粗制品，缺乏精細(xì)加工和深入研究，不能滿足市場的需求。

國內(nèi)外學(xué)者對蟲草中的活性物質(zhì)做了較多的研究，但不同類型、不同產(chǎn)地、不同培養(yǎng)條件的蟲草，其活性物質(zhì)存在一定的差異。C.H. Dong 等[6]研究表明，野生型與人工培養(yǎng)型蟲草的抗氧化活性有所不同。馬赟等[7]報道不同產(chǎn)地的新疆蟲草清除羥基自由基、超氧陰離子的能力和還原力具有一定的差異。羅建光[8]研究表明，發(fā)酵條件對冬蟲夏草菌絲體中多糖、腺苷、尿苷、蟲草素的含量和抗氧化、增強(qiáng)免疫等生物活性有較大影響。另外，多糖作為一種具有較好生物活性的高分子復(fù)合物，其化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)具有一定的復(fù)雜性。因此，厘清冬蟲夏草中種類豐富的多糖的構(gòu)效關(guān)系并用于指導(dǎo)功能性食品和新藥的開發(fā)已成其當(dāng)前研究的重點和難點。

1　實驗材料與試劑、儀器

1.1實驗材料

冬蟲夏草菌絲體粉，由浙江省杭州市百山祖生物科技有限公司提供。

1.2實驗試劑與儀器

DPPH、ABTS、脫氧核糖、硼氫化鈉、二甲基亞砜、三氟乙酸、碘甲烷及單糖標(biāo)準(zhǔn)品購于美國Sigma公司。填料DEAE-Sepharose Fast Flow 和Sephacryl S-400 購于美國GE公司。氯仿、甲醇、乙醇、乙酸、醋酐、甲苯、無水硫酸鈉等均為國產(chǎn)分析純。

高效液相色譜儀（2695）購于美國Waters公司，氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Finnigan Trace Ultra-DSQ II）購于美國Thermo Fisher公司，紫外-可見光光度計（UV-2450）購于日本島津公司。

2　實驗方法

2.1蟲草粗多糖提取

稱取100 g冬蟲夏草菌絲體干粉，脫脂處理后用超聲輔助法提取多糖。提取液離心過濾后經(jīng)40%、60%、80%分級醇沉得到CSP40、CSP60、CSP80三種粗多糖。

2.2抗氧化活性測定

（1）樣品溶液的配制。分別將冬蟲夏草多糖分級醇沉組分CSP40、CSP60、CSP80配成0.1 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、1.5 mg/mL、2.0 mg/mL、2.5 mg/mL、5.0 mg/mL 7個濃度的多糖溶液備用。

（2）DPPH自由基清除能力測定[9]。分別取不同濃度的多糖溶液2 mL與1 mL 0.2 mmol/L DPPH-甲醇溶液在25 ℃恒溫環(huán)境避光反應(yīng)1 h，然后在517 nm處測定吸光值。以同體積的蒸餾水替代多糖溶液作為空白對照組，測得吸光度；以同體積甲醇代替DPPH試劑作為樣品對照組，以消除多糖溶液自身對吸光值的影響。清除率計算公式為：。

（3）ABTS自由基清除能力測定。ABTS工作液按Roberta Re[10]報道的方法配制。取不同濃度的多糖溶液1 mL，分別與3 mL ABTS工作液在暗處反應(yīng)1 h，在734 nm波長處測得吸光值；以1 mL 純水代替樣品，在相同條件下測得吸光值；以3 mL 純水替代ABTS自由基溶液作為樣品對照組在相同條件下測得吸光值。清除率計算公式同上。

（4）羥基自由基清除能力測定。采用Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基，利用分光光度法測定粗多糖CSP40、CSP60、CSP80的羥基自由基清除能力[9]。

（5）還原力測定。采用普魯士藍(lán)法[11]測定CSP40、CSP60、CSP80的還原力。樣品中抗氧化劑將鐵氰化鉀還原成二價鐵，二價鐵進(jìn)一步與FeCl3反應(yīng)生成在700 nm處有最大吸光度的普魯士藍(lán)（Fe4[Fe(CN)6]3）。

2.3粗多糖CSP40的純化

采用 DEAE-Sepharose Fast Flow離子柱層析，分別用蒸餾水和0.1 mol/L、0.2 mol/L、0.4 mol/L、1.0 mol/L NaCl溶液對CSP40進(jìn)行梯度洗脫。每10 mL收集一試管，并用苯酚-硫酸法測定其吸光值。以吸光值為縱坐標(biāo)，管數(shù)為橫坐標(biāo)繪制總洗脫曲線。收集0.1 mol/L NaCl洗脫峰組分，脫鹽并冷凍干燥后得到CSP40-2。

采用Sephacryl S-400凝膠柱對CSP40-2樣品進(jìn)行進(jìn)一步純化，每5 mL收集一試管，并用苯酚-硫酸法測定其吸光值。以吸光值為縱坐標(biāo)，以管數(shù)為橫坐標(biāo)繪制洗脫曲線圖。

收集洗脫峰處組分，用高效液相色譜鑒定其純度。

2.4CSP40-2a的單糖組成測定

（1）單糖標(biāo)準(zhǔn)品的乙酰化處理。精確稱量2 mmol鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖溶于 3 mL蒸餾水中。用NaBH4還原單糖混標(biāo)，多余的NaBH4可與甲醇共蒸去除。單糖被還原成糖醇后，再用醋酐乙?；商谴家宜狨パ苌颷12]。乙?；a(chǎn)物溶于氯仿后用純水萃取除雜，氯仿層加入無水硫酸鈉除水干燥。上清液定容到10 mL，待GC-MS分析。

（2）CSP40-2a的乙酰化處理。精確稱量純多糖CSP40-2a 2 mg，置于梨形瓶中，加入4 mL三氟乙酸（2 mol/L，TFA）混勻后在110 ℃下密封水解2 h。水解完成后冷卻至室溫，40 ℃減壓蒸干，重復(fù)4～5次以除去三氟乙酸。然后按照步驟2.4（1）進(jìn)行還原和乙?；?，并用氯仿溶解定容至5 mL，待GC-MS分析。

（3）GC-MS條件[13]。柱溫從120 ℃以10 ℃/min升溫至240 ℃，保持 6.5 min。接口溫度250 ℃，離子源溫度為250 ℃，進(jìn)樣量1.0 μL，以氦氣作為載氣，流速為1.0 mL/min，質(zhì)量掃描范圍為40～500 amu，掃描時間為0.28 s。

3　結(jié)果與分析

3.1蟲草多糖的抗氧化活性

（1）DPPH自由基清除能力。不同濃度蟲草多糖醇沉組分的清除DPPH自由基的能力如圖1 （a）所示，Vc為陽性對照。CSP40、CSP60、CSP80清除DPPH自由基的能力均隨著濃度的升高而增強(qiáng)，且兩者具有一定的量效關(guān)系。在多糖濃度為5 mg/mL時，CSP40的DPPH自由基清除率最高，為 61.04±3.14%；CSP80稍次，為57.64±2.00% ； CSP60最 弱 ， 清 除 率 為48.19±1.78%；而此時的陽性對照組Vc的清除率為100%。在樣品濃度<3.0 mg/mL的低濃度范圍下，CSP40組分的 DPPH自由基清除能力強(qiáng)于CSP80組分，CSP60組分較弱。

圖1　蟲草多糖抗氧化活性

（2）ABTS自由基清除能力。不同濃度的蟲草多糖醇沉組分清除羥基自由基的能力如圖 1（b）所示，Vc為陽性對照。CSP40、CSP60、CSP80組分均顯示了較好的ABTS自由基清除能力，其自由基清除能力和濃度間存在顯著的量效關(guān)系。CSP40組分的ABTS自由基清除能力隨樣品濃度的增加，上升最快，1.5 mg/mL時達(dá)到高值，其清除率為92.08±3.29%；CSP80次之，在 2.0 mg/mL達(dá)到高值，清除率為89.26±1.40%；CSP60升幅較緩，在濃度為 2.5 mg/mL時，清除率為46.48±2.95%。在同樣濃度下，CSP40、CSP80組分和陽性對照Vc的清除率均接近100%。

（3）羥基自由基清除能力。不同濃度的蟲草多糖醇沉組分清除羥基自由基的能力如圖 1 （c）所示，Vc為陽性對照。CSP40、CSP60、CSP80組分的清除能力均隨著樣品濃度的升高而逐漸增強(qiáng)。在樣品濃度達(dá)到5 mg/mL時，CSP40的羥基自由基清除率在三組分中為最高，達(dá)63.90 ±4.14%；CSP80次之，為 56.90±2.33%；CSP60較低，為 40.40±3.46%。而此時的陽性對照 Vc羥基自由基清除率為100%。在樣品濃度低于2.5 mg/mL的低濃度區(qū)域，CSP40的羥基自由基清除能力遠(yuǎn)高于CSP60與CSP80組分。在樣品濃度高于2.5 mg/mL的高濃度區(qū)域，CSP80組分的羥基自由基清除能力隨著濃度的升高而有較大提高。

（4）還原力。研究表明，多糖的抗氧化活性與其還原力具有很強(qiáng)相關(guān)性?？寡趸钚赃€與還原酮類物質(zhì)有關(guān)，該類物質(zhì)可為終止自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)提供氫原子[11]。

不同濃度的蟲草多糖醇沉組分還原力如圖 1 （d）所示，Vc為陽性對照。CSP40、CSP60和CSP80的還原力與樣品濃度均具有顯著的量效關(guān)系。其中，CSP40還原力大于CSP80，CSP80大于CSP60。

圖2　冬蟲夏草多糖CSP40洗脫曲線

但CSP40、CSP60、CSP80組分均具有較好的抗氧化活性，且隨著濃度的升高而增強(qiáng)。CSP40、CSP60、CSP80對DPPH、ABTS自由基的清除能力較強(qiáng)，而對羥基自由基的清除能力則較弱。綜合上述4種指標(biāo)評估，該3種粗多糖的抗氧化活性從高到低排序為：CSP40＞CSP80＞CSP60。

3.2蟲草多糖CSP40的純化

（1）離子交換柱層析。由上述實驗可知蟲草多糖CSP40組分均具有較好的抗氧化活性，因此分離純化出一種活性純多糖，對進(jìn)一步探究多糖構(gòu)效關(guān)系有著重要的意義。

蟲草多糖CSP40洗脫曲線如圖2所示。蟲草多糖CSP40經(jīng)過DEAE-Sepharose Fast Flow分離后可得4個組分，分別為CSP40-1、CSP40-2、CSP40-3和CSP40-4。由圖2可知，CSP40-2峰形瘦高，對稱性好，峰面積大，含量較多，故收集該組分用于下一步實驗。收集的洗脫液經(jīng)Sephadex G25凝膠柱脫鹽后再作進(jìn)一步純化。

（2）凝膠柱層析。由上一步得到的CSP40-2洗脫組分經(jīng) Sephacryl S-400 凝膠柱層析的洗脫曲線如圖3所示。收集第14～19管洗脫液并冷凍干燥后命名為CSP40-2a。經(jīng)HPLC檢測，其峰形為單一對稱峰，證明為均一多糖組分[13]。

3.3CSP40-2a的單糖組成分析

（1）單糖混標(biāo)的乙?；-MS總離子流圖如圖4所示。混標(biāo)中各單糖保留時間見表2，其中RSD1為6次重復(fù)進(jìn)樣的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差；RSD2為6次平行實驗的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。經(jīng)計算，RSD1與RSD2均小于5%，說明乙?；治鲋噩F(xiàn)性良好，GC-MS儀器穩(wěn)定可靠。另由平均峰面積的百分含量可計算出各單糖組分相對于該儀器的響應(yīng)因子。

混標(biāo)中各單糖出峰時間從左到右分別是鼠李糖、海藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖。

（2）CSP40-2a 的乙?；?。多糖 CSP40-2a乙?；蠼?jīng)GC-MS測得總離子流圖如圖5所示。對照單糖乙?；苌颎C-MS總離子流圖和出峰的時間表可知，CSP40-2a主要由三種單糖組成，分別是D-甘露糖、D-葡萄糖和D-半乳糖，其摩爾比為1.98︰1.0︰0.67。

4　結(jié) 論

圖3　CSP40-2 Sephacryl S-400凝膠柱層析洗脫曲線

表2　混合標(biāo)準(zhǔn)品GC-MS結(jié)果

圖4　單糖混標(biāo)乙酰化衍生物GC-MS總離子流圖

圖5　CSP40-2a乙?；苌锟傠x子流圖

本研究采用超聲輔助提取工藝，并利用分級醇沉法得到 3種蟲草粗多糖 CSP40、CSP60、CSP80。通過抗氧化活性實驗得知，三者均具有較好的抗氧化活性，且隨著濃度的升高而增強(qiáng)。CSP40、CSP60和CSP80對DPPH和ABTS自由基的清除能力較強(qiáng)，而對羥基自由基的清除能力略弱?？傮w上，抗氧化活性從高到低排序為：CSP40＞CSP80＞CSP60?？寡趸钚暂^好的粗多糖CSP40經(jīng)DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析分離得到 CSP40-2組分，CSP40-2組分再經(jīng)Sephacryl S-400凝膠柱層析可得單一多糖組分CSP40-2a。利用GC-MS進(jìn)行乙?；治龅弥?CSP40-2a主要由 D-甘露糖、D-葡萄糖和D-半乳糖三種單糖組成，其摩爾比為 1.98︰1.0︰0.67。本文探究蟲草多糖抗氧化活性，并成功探索出一條從蟲草菌絲體中分離生物活性純多糖的工藝路線，為進(jìn)一步揭示其構(gòu)效關(guān)系和指導(dǎo)蟲草菌絲體的精細(xì)加工奠定了一定的基礎(chǔ)[14]。

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Antioxidant activities and monosaccharide composition analysis of Cordyceps sinensis polysaccharides

Zhang Anqiang1Wang Xiaochen1Wang Xingli2Qu Liang2Sun Peilong1Ma Xin1

(1.Ocean College, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China; 2. Hangzhou Baishanzu Biological Science and Technology Co. Ltd, Hangzhou 310052, China)

Three crude polysaccharide sections named CSP40, CSP60 and CSP80 were obtained by ultrasonic-assisted extraction and grading alcohol precipitation. Antioxidant activities of these three sections were tested and the most active section CSP40 was purified by DEAE-Sepharose Fast Flow and Sephacryl S-400 chromatography. The monosaccharide composition of the pure polysaccharide named CSP40-2a was analyzed by GC-MS after acetylation. Result showed that CSP40, CSP60 and CSP80 had a good ablility of antioxidant and the order was CSP40>CSP80>CSP60. Acetylating analysis by GC-MS indicated that CSP40-2a was composed of D-Mannose, D-Glucose and D-Galactose at the rate of 1.98: 1.0: 0.67.

Cordyceps sinensis polysaccharides; antioxidants; purification; monosaccharide composition

S567.3+5

A

2095-0934（2015）04-237-06

十二五國家科技支撐項目課題“食用菌深加工產(chǎn)品開發(fā)與產(chǎn)業(yè)化”（2013BAD16B07）

*為通訊作者，E-mail: sun_pl@zjut.edu.cn