王 娟，韓 濤，司友斌（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，安徽 合肥 230036）

Shewanella oneidensis MR-1對不同價態(tài)砷的生物轉(zhuǎn)化與甲基化

王 娟，韓 濤，司友斌*（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，安徽 合肥 230036）

在實驗室純培養(yǎng)條件下，通過分別向培養(yǎng)基中投加As（III）和As（V），探討Shewanella oneidensis MR-1對不同價態(tài)砷的生物轉(zhuǎn)化與甲基化作用.結(jié)果表明，S. oneidensis MR-1介導(dǎo)下不同價態(tài)砷的生物轉(zhuǎn)化與微生物對砷的耐受和代謝特性有著密切聯(lián)系，在投加As（III）時，由于細胞自身的解毒作用會產(chǎn)生少量的As（V），同時在酶的作用下As（III）與甲基供體結(jié)合生成甲基砷；而在投加As（V）時，遵循Challenge機制，先產(chǎn)生一甲基砷后生成二甲基砷.此外，弱酸性環(huán)境比堿性更有利于甲基砷的產(chǎn)生；溫度 30℃時甲基砷的產(chǎn)生量較高，過低或過高的培養(yǎng)溫度砷甲基化率下降.

As（III）；As（V）；甲基化；生物轉(zhuǎn)化

環(huán)境中的類金屬物質(zhì)在微生物作用下其形態(tài)會發(fā)生轉(zhuǎn)變，例如氧化、還原、甲基化以及氫化物發(fā)生［1］.當類金屬元素形態(tài)發(fā)生改變時，其物理、化學(xué)性質(zhì)也發(fā)生變化，從而導(dǎo)致環(huán)境中遷移特性以及毒性的改變.砷是世界大部分地區(qū)的主要污染物之一，其化學(xué)結(jié)構(gòu)對溶解度和氧化還原起著至關(guān)重要的作用［2］，通常來說三價砷的毒性大于五價砷［3］.砷甲基化被認為是解毒過程，其原因是產(chǎn)生了毒性較小的五價甲基砷，但是代謝產(chǎn)物中的揮發(fā)性一甲基砷（MMAⅢ）和二甲基砷（DMAⅢ）比亞砷酸鹽的毒性更強［4］，而不易揮發(fā)的一甲基砷（MMAⅤ）和二甲基砷（DMAⅤ）的毒性比無機砷的毒性小幾十倍［5］.因此，環(huán)境中類金屬元素的氧化還原和甲基化程度是評估其環(huán)境影響的重要因素.

砷甲基化途徑已被一些學(xué)者提出［6］，其中砷甲基轉(zhuǎn)移酶 ArsM被證實能利用活性腺苷甲硫氨酸 （S-adenosyl methionine，SAM）作為甲基供體將不同價態(tài)無機砷轉(zhuǎn)化為有機砷.目前研究得出的砷甲基化機制主要分為2種，一是胞內(nèi)還原性谷胱甘肽GSH對As（V）進行逐步還原，利用游離態(tài)甲基供體進行氧化甲基化［7］；另一個理論為砷離子直接與甲基供體結(jié)合生成甲基砷［8］.SAM在甲基化過程中能被汞、鉛、鈀、砷等元素所利用，當甲基基團轉(zhuǎn)移的概念提出后，證實是由于電子轉(zhuǎn)移所引起的自由基形成，介導(dǎo)甲基化過程發(fā)生.兩種甲基化機制闡釋了不同價態(tài)砷作為反應(yīng)底物時的甲基化過程.以真菌類及酵母菌類作為生物甲基化研究對象［9］，添加 As（V）作為反應(yīng)底物，證實在微生物介導(dǎo)下As（V） 逐步還原然后氧化甲基化生成甲基砷.以球藻及其他浮游生物作為研究對象時［10-11］，添加As（III）作為反應(yīng)底物，證實 As（III）也能被改變形態(tài)生成甲基砷，而這種甲基化過程被認為是砷離子直接對甲基集團的接收［8］.微型海洋藻類Ostreococcus tauri分別暴露于 As（III）及 As（V）的培養(yǎng)液中，能利用不同價態(tài)砷進行甲基化［12］.

除了不同甲基化機制的提出，微生物中各種功能性蛋白所擔當?shù)淖饔靡脖谎芯繄蟮?原核生物的甘油轉(zhuǎn)運蛋白GlpF將As（III）運轉(zhuǎn)至細胞內(nèi)，As（V）可以通過無機磷酸鹽轉(zhuǎn)運系統(tǒng)（Pit）和磷酸鹽特殊轉(zhuǎn)運系統(tǒng)（Pst）吸收進入細胞［13］.真菌、細菌和某些藻類等都可經(jīng)甲基化過程產(chǎn)生氣態(tài)的揮發(fā)性砷化合物，也是生物對 As（III）解毒的一個重要途徑［9］.微生物對不同形態(tài)砷的吸收、運轉(zhuǎn)和外排的途徑和速率存在不同，以往實驗大多單獨研究不同形態(tài)砷的甲基化，沒有將細菌甲基化過程進行一個整體研究，使得不同價態(tài)砷生物轉(zhuǎn)化機制較為模糊. Shewanella oneidensis MR-1屬于典型的鐵還原菌， 在還原 Fe（Ⅲ）的同時，可使As（Ⅲ）氧化成As（Ⅴ），從而起到解毒作用［14］.但是Shewanella oneidensis MR-1 對于砷的生物轉(zhuǎn)化與甲基化研究較少，本研究在實驗室模擬條件下，通過向反應(yīng)體系中分別添加As（III）和As（V）與微生物混合培養(yǎng)，探討S. oneidensis MR-1對不同價態(tài)砷的生物轉(zhuǎn)化與甲基化作用.

1　材料與方法

1.1實驗材料

亞砷酸鈉（NaAsO2，純度＞95%）；砷酸氫二鈉（Na2HAsO4·7H2O，純度＞95%）；砷標準儲備液購于國家標準物質(zhì)研究中心，于 4℃冰箱保存，實驗所需稀溶液用去離子水依次逐級稀釋. 一甲基砷酸鈉（MMA，純度83.3%）；二甲基砷酸鈉（DMA，純度＞95%），購于Dr. Ehernstorfer GmbH德國實驗室.鹽酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、硼氫化鉀均為優(yōu)級純，其他試劑均為分析純.

活性腺苷甲硫氨酸（SAM，純度＞98%），購于西亞試劑公司.

菌種來源：S. oneidensis MR-1由西北農(nóng)林科技大學(xué)土壤微生物實驗室提供.

S. oneidensisMR-1培養(yǎng)基（g/L）：KH2PO4·7H2O 3.0，Na2HPO4·7H2O 12.8，NH4Cl 1.0，NaAc 2.0，酵母抽提物2.0.

LB培養(yǎng)基（g/L）：牛肉膏 5.0，蛋白胨 10.0，NaCl5.0， pH值調(diào)至 7.0左右；固體培養(yǎng)基再按1.5%～2.0%的比例加入瓊脂粉，121℃滅菌30min.

圖1　S.oneidensis MR-1菌體形態(tài)Fig.1 The mycelial morphology for S.oneidensis MR-1

S. oneidensis MR-1生長條件：在固體LB培養(yǎng)基中，電熱恒溫30℃培養(yǎng)，經(jīng)過48h培養(yǎng)生長，呈圓形、橘黃色、無光澤、表面光滑、邊緣規(guī)則的菌落.在液體LB培養(yǎng)基中， 30℃恒溫振蕩，搖菌轉(zhuǎn)速180r/min，經(jīng)過24h培養(yǎng)進入對數(shù)生長期.如圖1所示，S.oneidensis MR-1菌體長度約為1.49μm（圖1A），以二分裂的形式進行無性繁殖（圖1B）.

1.2實驗方法

將S.oneidensis MR-1菌懸液1mL無菌操作接種至含有液體 LB培養(yǎng)基的棕色瓶中，分別添加As（III）或As（V）溶液和5.0mg/L SAM，充氮除氧，加蓋密封.置于30℃搖床中150r/min振蕩培養(yǎng)，定期采集樣品，測定培養(yǎng)液及細胞中不同形態(tài)砷濃度變化.同時設(shè)置不添加 S.oneidensis MR-1菌懸液和SAM甲基供體作為對照.每處理3次重復(fù).

菌株的厭氧培養(yǎng)：在超凈厭氧工作臺上，將高純氮氣通過一個裝有細菌過濾器的塑膠管充入裝有培養(yǎng)液的棕色瓶中，充氣15min后，快速擰緊瓶蓋密封后置于30℃恒溫振蕩培養(yǎng).

pH值和溫度對砷甲基化的影響：分別調(diào)節(jié)液體培養(yǎng)基的pH值和培養(yǎng)溫度，添加As（V）溶液作為試驗底物，充氮除氧，密閉培養(yǎng)，研究pH值和溫度對S.oneidensis MR-1砷甲基化的影響.

1.3樣品處理

培養(yǎng)液中砷提?。?5］：將棕色瓶中溶液倒入離心管中，并用超純水清洗內(nèi)壁，并倒入離心管，7000r/min離心20min，收集上清液，過0.45μm水系濾頭去除細菌等雜質(zhì)，收集處理后的上清液樣品，采用LC-AFS對培養(yǎng)基中不同形態(tài)砷進行測定.

細菌體內(nèi)各形態(tài)砷提?。簩⑴囵B(yǎng)基中離心收集的濕菌體加入適量的生理鹽水，以 4000r/min離心潤洗 3遍，去除菌體表面代謝廢物，并置于80℃水浴中使菌體失活.將潤洗滅活后的濕菌體置于離心管中，加入30mL無菌生理鹽水，采用超聲波細胞破碎儀以70%的功率破碎 30min，觀察到菌液呈半透明狀時破碎完成.將破碎后菌液以7000r/min離心20min，收集上清液，過0.45μm水系濾頭，測定菌體細胞中As（III）、As（V）、MMA、DMA含量.

1.4砷形態(tài)測定

4種不同形態(tài)砷測定采用LC-AFS 9700液相色譜原子熒光聯(lián)用儀（北京海光儀器有限公司）.測定條件：（1）液相色譜分離： 流動相為 pH 5.92的磷酸鹽緩沖溶液（磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀），采用等度洗脫、恒流模式；樣品進樣體積100μL，泵流量1.0mL/min，泵轉(zhuǎn)速60r/min.（2）原子熒光測試：以5% 鹽酸溶液為載流，20g/L堿性硼氫化鉀溶液為還原劑；載氣流量300mL/min，屏蔽氣流量900mL/min，主電流80mA，輔電流40mA，負高壓 300V，原子化溫度 200℃，原子化器高度10mm.在該測定條件下，As（III）、DMA、MMA、As（V）4種形態(tài)砷的保留時間分別為 2.75， 3.44，4.26， 6.67min.

無機砷的甲基化率按照培養(yǎng)液中生成的甲基砷濃度計算，相關(guān)數(shù)據(jù)分析用 Sigma plot 12.5 和Origin 9.1軟件處理.

2　結(jié)果與分析

2.1S.oneidensis MR-1在不同砷濃度培養(yǎng)基中的生長曲線

圖2　S. oneidensis MR-1在含不同濃度As（III）和As（V）培養(yǎng)基中的生長曲線Fig.2 Growth curves for S. oneidensis MR-1in the medium containing different concentration of As （III） and As（V）

如圖2所示，添加As（III）或As（V）到培養(yǎng)基中對S.oneidensis MR-1生長具有一定的抑制作用，但對細胞的最大生長量沒有顯著影響.當培養(yǎng)基中As（III）濃度為0.50， 1.00mg/L時S.oneidensis MR-1進入對數(shù)生長期的時間分別比對照延長了 18， 24h.而 As（V）濃度為 1.00mg/L時，S.oneidensis MR-1對數(shù)生長期僅延長 12h，表明As（III）對S. oneidensis MR-1的生長抑制作用比As（V）強烈，其毒性更大.

2.2S.oneidensis MR-1對As （III）的生物轉(zhuǎn)化與甲基化

由圖 3可見，隨著反應(yīng)時間增加，培養(yǎng)液中As（III）濃度顯著下降，并伴隨產(chǎn)生少量的 As（V），而DMA濃度明顯增加，并在6d后逐漸達到飽和.細胞中砷形態(tài)變化，反應(yīng)初期（1～3d）產(chǎn)生少量As（V）、MMA和DMA，細胞中As（III）濃度遠高于其他形態(tài)砷，說明在甲基化初始階段 As（III）的毒性較高，難以被S.oneidensis MR-1菌體細胞所利用，產(chǎn)生少量 As（V）屬于應(yīng)激解毒反應(yīng).菌體數(shù)量在反應(yīng)初期（1～3d）顯著增加，與細胞內(nèi) MMA含量變化趨勢一致.隨著S.oneidensis MR-1菌體逐步適應(yīng)環(huán)境，As（III）濃度迅速下降，MMA濃度顯著增加，MMA進一步甲基化產(chǎn)生DMA. 1～4d時細胞中MMA濃度逐漸升高，此后MMA濃度呈現(xiàn)先上升后下降趨勢， DMA濃度緩慢上升，表明DMA濃度的變化具有滯后性.

圖3　As（III）為反應(yīng)底物時培養(yǎng)液與菌體內(nèi)各形態(tài)砷濃度變化和細胞生長曲線Fig.3 The growth curve and the change in arsenic concentrations in the medium and cell by S. oneidensis MR-1enriched with arsenite

2.3S. oneidensis MR-1對As（V）的生物轉(zhuǎn)化與甲基化

圖4　As（V）為反應(yīng)底物時培養(yǎng)液與菌體內(nèi)各形態(tài)砷濃度變化和細胞生長曲線Fig.4 The growth curve and the change in arsenic concentrations in the medium and cell by S. oneidensis MR-1enriched with arsenate

由圖 4可見，隨著反應(yīng)時間增加，培養(yǎng)液中As（V）濃度下降，并產(chǎn)生 As（III）， As（III）作為Challenge機制中被還原后氧化甲基化的中間產(chǎn)物，其濃度隨著反應(yīng)時間增加而下降. DMA濃度以先快后慢的趨勢后升高，表明 S.oneidensis MR-1可在甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下使甲基供體與培養(yǎng)基中As（V）作用，生成DMA.培養(yǎng)液中的菌體數(shù)量在3d時達到峰值， 隨后細胞新陳代謝變慢， 使得細胞內(nèi) MMA含量逐漸變低.細胞中無機砷As（V）和 As（III）濃度，隨反應(yīng)時間增加不斷降低，MMA和DMA濃度逐漸升高，4d時MMA濃度達到峰值，而DMA濃度在5～6d時仍增加較快，說明與MMA相比DMA濃度變化具有滯后性.由于MMA只在細胞中產(chǎn)生，MMA作為生物砷甲基化的第一甲基產(chǎn)物，是產(chǎn)生DMA的必要前提.

2.4初始pH值對砷甲基化的影響

圖5　初始pH值對S.oneidensis MR-1砷生物甲基化和細胞生長影響Fig.5 Effect of pH on arsenic biomethylation and the growth for S. oneidensis MR-1

由圖5可見，S. oneidensis MR-1作用下不同pH值培養(yǎng)基中 DMA濃度有著明顯差異， 弱酸性條件下生成的DMA濃度高于堿性環(huán)境，表明S. oneidensis MR-1在弱酸性條件下砷甲基化的效率較高.通常來說，弱酸性條件更加有利于微生物甲基化過程的形成［16］，使砷甲基化效率更高.在不同 pH值生長條件下，菌體數(shù)量在同一時間（3～4d）達到峰值，但弱酸性條件下菌體最大生長量大于弱堿性條件.相對于堿性條件，弱酸性環(huán)境中 S. oneidensis MR-1的生長趨勢更好［17］，而砷甲基化效率與微生物生長狀況有較大關(guān)系，故能更好地利用環(huán)境中甲基自由基生成甲基砷.

2.5培養(yǎng)溫度對砷甲基化的影響

由圖6可見，不同培養(yǎng)溫度條件下，培養(yǎng)基中生成的DMA濃度有著顯著差異，說明溫度對砷甲基化效率影響較大，30℃時S. oneidensis MR-1作用下的砷甲基化效率明顯高于其他培養(yǎng)溫度，不同溫度下砷甲基化效率大小順序為：30℃＞40℃＞20℃. S. oneidensis MR-1介導(dǎo)的砷生物甲基化效率與溫度并沒有呈現(xiàn)出正相關(guān)的關(guān)系，說明適宜溫度有利于甲基砷生成.同時，菌體生長狀況與溫度有著密切聯(lián)系.不同培養(yǎng)溫度下菌體數(shù)量最先達到對數(shù)期的順序為：40℃、30℃、20℃，與甲基化效率亦無相關(guān)關(guān)系，說明甲基化率與微生物最適生長條件有關(guān).

圖6　培養(yǎng)溫度對S. oneidensis MR-1砷甲基化影響和細胞生長曲線Fig.6 Effect of culture temperature on arsenic biomethylation and the growth for S. oneidensis MR-1

研究表明，在春秋2季時湖泊中的As（III）含量達到四季中的峰值，而在夏季時湖泊中的DMA含量達到最大值［18］.上述實驗結(jié)果也從溫度因素驗證了湖泊水體中As（III）、甲基砷濃度隨季節(jié)產(chǎn)生變化的原因.

3　討論

砷和磷因化學(xué)性質(zhì)相似共享細胞運輸途徑，砷通過磷酸鹽運輸途徑進入細胞［10，18-19］.由于無機砷具有較高毒性，故進入環(huán)境后被水體及沉積物中微生物以自身代謝形式進行甲基化解毒［20］.砷甲基化擴展模型包括細胞內(nèi)的自身代謝及培養(yǎng)液中砷的釋放［21］，通過砷甲基化產(chǎn)物反應(yīng)速率得出無機砷與甲基供體結(jié)合、產(chǎn)生甲基產(chǎn)物的順序［19］.培養(yǎng)液中添加不同價態(tài)砷時，S. oneidensis MR-1作用下砷的生物轉(zhuǎn)化及甲基化過程存在差異.當以As（III）作為反應(yīng)底物時，細菌體內(nèi) ArsB基因編碼一個12α螺旋跨膜蛋白［22］，調(diào)控微生物對As（III）的抗性［23］，微生物應(yīng)激解毒產(chǎn)生 As（V）.培養(yǎng)液中 As（V）濃度又遠遠小于DMA濃度（圖3），說明培養(yǎng)液中大部分DMA是由 As（III）直接與游離的甲基供體結(jié)合產(chǎn)生，證實Hayakawa等［8］所提出的直接甲基化作用.研究表明，As（III）被生物體利用產(chǎn)生甲基砷是一種解毒過程［24-25］（圖 7），但也有學(xué)者［26-28］認為以 As（III）作為反應(yīng)底物時，會產(chǎn)生更高毒性的甲基砷產(chǎn)物，如MMAⅢ、DMAⅢ，這些揮發(fā)性的甲基砷也是生物解毒機制的表現(xiàn)，使得液體培養(yǎng)基中可溶性甲基砷含量較低.當以As（V）作為反應(yīng)底物時， As（V）先被還原后逐步氧化甲基化.培養(yǎng)液中產(chǎn)生的As（III）僅作為甲基化過程中間產(chǎn)物，隨著反應(yīng)進行還原態(tài) As（III）與甲基供體結(jié)合先生成 MMA后進一步形成DMA（圖7），故As（III）濃度在反應(yīng)后期很低（圖4）.

培養(yǎng)液中以As（III）和As（V）不同價態(tài)砷作為反應(yīng)底物時，細胞中DMA濃度變化均明顯滯后于 MMA，說明甲基化產(chǎn)物的生成順序不因價態(tài)不同而發(fā)生變化.不同價態(tài)砷對甲基化的影響不僅從甲基化機制上有所不同，也可能由于不同價態(tài)砷本身的性質(zhì)不同而導(dǎo)致對MMA和DMA濃度變化造成影響.生物甲基化過程與生物、化學(xué)、環(huán)境因素息息相關(guān)，如砷形態(tài)、生物活性、溫度、pH以及水體中磷含量［29］、鐵鋁微量元素等其他營養(yǎng)物質(zhì)的濃度［30-33］.所以砷甲基化并不能單單以一種機制進行簡單研究，不同形態(tài)砷對甲基化的影響只是其中一方面，需要進一步開展生物體砷代謝過程中的信號傳導(dǎo)研究，探究其代謝機理的工作還有待進行.

圖7　微生物介導(dǎo)下不同價態(tài)砷生物轉(zhuǎn)化與甲基化示意Fig.7 The sketch for biotransformation and methylation of different valence state arsenic mediated by the microbe

4　結(jié)論

4.1在S. oneidensis MR-1作用下培養(yǎng)液中砷形態(tài)發(fā)生了改變，As（III）或 As（V）在胞內(nèi)與甲基供體結(jié)合產(chǎn)生一甲基砷，進一步甲基化產(chǎn)生二甲基砷.

4.2在S. oneidensis MR-1作用下，以As（III）為反應(yīng)底物時，As（III）直接與甲基供體結(jié)合產(chǎn)生甲基砷；以As（V）為反應(yīng)底物時，先逐步還原后進行氧化甲基化.

4.3在弱酸性條件下S. oneidensis MR-1介導(dǎo)的砷甲基化效率高于堿性環(huán)境； 30℃培養(yǎng)溫度下砷甲基化效率高于其他試驗溫度，不同溫度下砷甲基化效率大小順序為：30℃＞40℃＞20℃.

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Biotransformation and methylation of different valence state arsenic by Shewanella oneidensis MR-1.

WANG Juan，HAN Tao， SI You-bin*（School of Resources and Environment， Anhui Agricultural University， Hefei 230036， China）.

China Environmental Science， 2015，35（11）：3396～3402

The biotransformation and methylation of arsenic by Shewanella oneidensis MR-1 were studied under laboratory condition with the addition of As （III） and As （V） respectively to the culture medium. The result showed the biotransformation of arsenic by S. oneidensis MR-1 was dependent on microbe tolerance and metabolism. When As （III）was added to the medium， a small quantity of As （V） was generated by S. oneidensis MR-1for detoxification， meanwhile organic arsenic was generated by the action of methyltransferase. When As （V） was added to the medium，monomethylarsine and dimethylarsine were produced step by step through the Challenge mechanism. In addition， weakly acidic environment was more beneficial to arsenic methylation than alkaline condition. When the culture temperature was 30℃， the arsenic methylation rate was higher than others.

As （III）；As（V）；methylation；biotransformation

X172

A

1000-6923（2015）11-3396-07

2015-03-27

國家自然科學(xué)基金項目（41171254）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項經(jīng)費課題（20130301-06）

* 責任作者， 教授， youbinsi@ahau.edu.cn

王 娟（1989-），女，湖北武漢人，安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)博士研究生，主要從事環(huán)境生物修復(fù)技術(shù)研究.發(fā)表論文3篇.