黃敏芳，唐志列，2，3，吳泳波，2，3

（1.華南師范大學(xué)物理與電信工程學(xué)院，廣東廣州510006；2.廣東省量子調(diào)控工程與材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510006；3.廣東省光電檢測(cè)儀器工程技術(shù)研究中心，廣東廣州510006）

利用散射光聲微分成像技術(shù)實(shí)現(xiàn)弱吸收物質(zhì)顯微成像

黃敏芳1，唐志列1，2，3，吳泳波1，2，3

（1.華南師范大學(xué)物理與電信工程學(xué)院，廣東廣州510006；2.廣東省量子調(diào)控工程與材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510006；3.廣東省光電檢測(cè)儀器工程技術(shù)研究中心，廣東廣州510006）

光聲顯微成像技術(shù)依賴于樣品的內(nèi)源性光吸收，對(duì)強(qiáng)散射弱吸收樣品成像效果差，甚至無法進(jìn)行成像。為了實(shí)現(xiàn)強(qiáng)散射弱吸收高透明生物樣品的光聲顯微成像，以及獲得圖像的邊緣增強(qiáng)效果，使光聲顯微成像技術(shù)在實(shí)際的生物醫(yī)學(xué)研究中更有應(yīng)用價(jià)值，本文首次將散射光聲技術(shù)引入到光聲微分顯微技術(shù)中，研制了新型的散射光聲微分成像技術(shù)。該技術(shù)不僅可以獲得強(qiáng)散射弱吸收高透明生物樣品的散射光聲顯微圖像，還可以獲得對(duì)應(yīng)的邊緣清晰的散射光聲微分圖像，對(duì)在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域有重要的應(yīng)用意義。

光聲顯微術(shù)；邊緣增強(qiáng)；散射光聲技術(shù)；空間微分技術(shù)

0 引言

微分顯微技術(shù)具有增強(qiáng)邊緣與突出微細(xì)結(jié)構(gòu)的優(yōu)勢(shì)［1，2］，而光聲顯微鏡具有實(shí)現(xiàn)高對(duì)比度與高分辨率的免標(biāo)記功能成像的優(yōu)勢(shì)［3-5］，將這兩種技術(shù)結(jié)合形成一個(gè)新的技術(shù)--光聲微分顯微技術(shù)，可將二者的優(yōu)勢(shì)結(jié)合，在對(duì)樣品進(jìn)行高對(duì)比度與高分辨率免標(biāo)記光聲成像的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)邊緣的增強(qiáng)與微細(xì)結(jié)構(gòu)的突出［6］。然而，光聲微分顯微鏡技術(shù)無法對(duì)強(qiáng)散射弱吸收樣品進(jìn)行成像，因?yàn)槠涫腔趥鹘y(tǒng)的光聲顯微鏡技術(shù)，依賴于樣品的內(nèi)源性光吸收，而強(qiáng)散射弱吸收樣品的光吸收非常弱，產(chǎn)生的光聲信號(hào)太弱無法實(shí)現(xiàn)有效探測(cè)［3，7，8］。由于在實(shí)際的生物醫(yī)學(xué)研究中，腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞等的生長(zhǎng)形態(tài)、生長(zhǎng)和繁殖等是研究的熱點(diǎn)內(nèi)容［9，10］，而這些細(xì)胞樣品一般都是光吸收能力差。因此，為了使光聲微分顯微技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)強(qiáng)散射弱吸收樣品的光聲顯微成像以及獲得邊緣增強(qiáng)效果，本文在光聲微分技術(shù)的基礎(chǔ)上引入了散射光聲成像技術(shù)，利用該技術(shù)獲得了強(qiáng)散射弱吸收細(xì)胞的高對(duì)比度的光聲圖像，以及邊緣清晰的散射光聲微分圖像，使得光聲成像技術(shù)應(yīng)用在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中更具意義。

1　散射光聲微分的原理

散射光聲微分顯微鏡技術(shù)本質(zhì)上是在散射光聲顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上引入空間微分技術(shù)。散射光聲顯微鏡技術(shù)是采用光聲探測(cè)技術(shù)探測(cè)被強(qiáng)散射弱吸收樣品散射的光子，再將光信號(hào)轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，通過采集與處理電信號(hào)，重構(gòu)樣品的散射光聲顯微圖像。而空間微分技術(shù)是利用空間互補(bǔ)調(diào)制的方法將入射光束I調(diào)制成兩束強(qiáng)度相同、相位相反的光束，這兩束調(diào)制光束的表達(dá)式分別為I1（t）=I0cos（ωt）與I2（t +△t）=I0cos（ωt+π），再使入射激光連續(xù)掃描，實(shí)現(xiàn)兩束調(diào)制光束到達(dá)樣品上的空間兩點(diǎn)距離足夠小，即實(shí)現(xiàn)△x→0。

由于在散射光聲顯微鏡技術(shù)中，探測(cè)到的光聲信號(hào)是來自樣品的散射光聲信號(hào)與樣品自身吸收產(chǎn)生的光聲信號(hào)的疊加，但由于強(qiáng)散射弱吸收樣品自身光吸收很弱，光散射很強(qiáng)，故探測(cè)到的光聲信號(hào)主要是散射光聲信號(hào)，而散射光聲信號(hào)與樣品的散射光強(qiáng)度I成正比。因此，當(dāng)兩束光I1、I2先后聚焦到樣品的某一點(diǎn)產(chǎn)生散射光聲信號(hào)后，光聲探測(cè)器接收到的散射光聲信號(hào)為：

其中C是與實(shí)驗(yàn)條件有關(guān)的常數(shù)，a（x）是樣品的光散射系數(shù)。由上式可知，互補(bǔ)調(diào)制技術(shù)實(shí)現(xiàn)了強(qiáng)散射弱吸收樣品的散射光聲信號(hào)的差分。

根據(jù)數(shù)學(xué)推導(dǎo)，光聲探測(cè)器最后探測(cè)到的散射光聲微分信號(hào)即散射光聲信號(hào)S（x）對(duì)樣品上對(duì)應(yīng)空間位置x的微分，可表示為：式中S（x+△x）和S（x）分別代表成像樣品在x+△x和x處產(chǎn)生的散射光聲信號(hào)。

當(dāng)樣品上相鄰兩點(diǎn)的散射光聲信號(hào)強(qiáng)度相同時(shí)，光聲探測(cè)器探測(cè)到的信號(hào)強(qiáng)度為零，當(dāng)相鄰兩點(diǎn)的散射光聲強(qiáng)度不相同時(shí)，則光聲探測(cè)器探測(cè)到一個(gè)不為零的散射光聲信號(hào)。在樣品的邊緣位置或有變化結(jié)構(gòu)位置時(shí)，空間相鄰兩點(diǎn)的散射光聲信號(hào)差異較大，因此散射光聲微分顯微成像技術(shù)能實(shí)現(xiàn)強(qiáng)散射弱吸收物質(zhì)的邊緣信號(hào)提取，實(shí)現(xiàn)邊緣增強(qiáng)。即散射光聲微分顯微鏡技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)強(qiáng)散射弱吸收物質(zhì)的微分圖像即邊緣增強(qiáng)的散射光聲顯微圖像的獲取。

2　實(shí)驗(yàn)裝置

如圖1，散射光聲微分顯微成像系統(tǒng)主要是由風(fēng)冷氬離子激光器（波長(zhǎng)為514.5nm，Argon ion laser，35LAL515-230，CVIMelles Griot）、互補(bǔ)光調(diào)制器、振鏡驅(qū)動(dòng)器（6231C，Cambridge Technology）、微腔散射光聲探測(cè)器、前置放大器、鎖相放大器（SR830，Stan-ford Research Systems）、數(shù)據(jù)采集卡（PCI6115，Na-tional Instrument）、以及計(jì)算機(jī)構(gòu)成。其中，互補(bǔ)調(diào)制器、微腔散射光聲探測(cè)器和前置放大器為本課題組自主研發(fā)。

圖1　散射光聲微分顯微成像系統(tǒng)原理圖Fig.1 The experimental setup of scattering photoacoustic differentialm icroscopy

氬離子激光器輸出的激光被半透半反鏡分束后，經(jīng)互補(bǔ)調(diào)制器調(diào)制成強(qiáng)度相等、相位相反的兩束光。兩束調(diào)制后的光再次聚合，入射到振鏡驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)，出射后被顯微物鏡聚焦在成像物體上。樣品所激發(fā)的散射光聲信號(hào)被微腔散射光聲探測(cè)器所探測(cè)，由于探測(cè)到的散射光聲信號(hào)十分微弱，因此，利用自行設(shè)計(jì)的前置放大器對(duì)光聲信號(hào)進(jìn)行預(yù)放大，接著使用鎖相放大器對(duì)被調(diào)制的光聲信號(hào)進(jìn)行解調(diào)并進(jìn)一步放大。利用互補(bǔ)調(diào)制器，微腔散射光聲探測(cè)器探測(cè)到的是成像物體上相鄰兩點(diǎn)的微分散射光聲信號(hào)。將該信號(hào)輸送到數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)中，通過計(jì)算機(jī)算法可以重建出成像物體二維空間分布的散射光聲微分顯微圖像，即散射光聲微分顯微圖像。

3　實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析討論

3.1光聲微分顯微成像

為了驗(yàn)證利用互補(bǔ)調(diào)制技術(shù)結(jié)合激光掃描技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)光聲微分，實(shí)驗(yàn)采取標(biāo)準(zhǔn)分辨率板（JJG 827-1993，RTA-07）作為成像物體。顯微物鏡的放大倍數(shù)為50×（NA=0.65），實(shí)驗(yàn)過程中，我們對(duì)分辨率板上的同一目標(biāo)分別利用光聲微分顯微、光聲顯微鏡和光學(xué)顯微鏡成像，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

圖2　分辨率版成像。（a）光聲微分圖像；（b）光聲圖像；（c）光學(xué)顯微鏡圖像Fig.2 Images of resolution plate：（a）photoacoustic differential imaging；（b）photoacoustic imaging（c）opticalmicroscopy

圖2（a）是分辨率板的光聲微分圖像，即邊緣增強(qiáng)光聲顯微圖像，圖2（b）是對(duì)應(yīng)的光聲圖像，而圖2（c）則是對(duì)應(yīng)的光學(xué)顯微圖像。從圖2（b）和（c）可看出，光點(diǎn)入射于分辨率板上的暗區(qū)時(shí)產(chǎn)生強(qiáng)光聲信號(hào)，光點(diǎn)入射于透明區(qū)則產(chǎn)生弱光聲信號(hào)。分辨率板的光聲顯微圖像2（b）和對(duì)應(yīng)的光聲微分顯微圖像2（a）結(jié)構(gòu)清晰，對(duì)比度高。在分辨率測(cè)試板中，當(dāng)空間上連續(xù)被掃描的兩點(diǎn)是在分辨率板中的暗區(qū)或透明區(qū)上，這兩點(diǎn)對(duì)應(yīng)的光吸收系數(shù)相等，產(chǎn)生的光聲信號(hào)相等，微腔散射光聲探測(cè)器的輸出為零；如果連續(xù)被掃描的兩點(diǎn)處于暗區(qū)或透明區(qū)的邊緣位置，它們對(duì)應(yīng)的光吸收系數(shù)不等，產(chǎn)生的光聲信號(hào)不能相消為零，則微腔散射光聲探測(cè)器就會(huì)輸出一個(gè)脈沖信號(hào)，用鎖相放大器把該脈沖信號(hào)檢測(cè)出來，用該信號(hào)進(jìn)行成像，經(jīng)過計(jì)算機(jī)處理就可以得到光聲微分圖像。綜上所述，利用互補(bǔ)光調(diào)制器結(jié)合激光掃描技術(shù)，可以成功實(shí)現(xiàn)光聲顯微鏡微分成像。

3.2散射光聲顯微成像及散射光聲微分顯微成像

為了驗(yàn)證散射光聲微分顯微鏡系統(tǒng)能實(shí)現(xiàn)強(qiáng)散射弱吸收樣品的成像，獲取樣品微分圖像即邊緣增強(qiáng)的散射光聲顯微圖像的可行性，以強(qiáng)散射弱吸收的口腔上皮細(xì)胞作為樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)采用40×（NA=0.65）的顯微物鏡，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

圖3　口腔上皮細(xì)胞成像。（a）散射光聲微分圖像；（b）散射光聲圖像；（c）光學(xué)顯微鏡圖像；（d）圖（a）標(biāo)示位置的數(shù)據(jù)圖像；（e）圖（b）標(biāo)示位置數(shù)據(jù)圖像Fig.3 Images of oral epithelial cell：（a）photoacoustic differential imaging；（b）scattering photoacoustic imaging；（c）opticalmicroscopy；（d）signals image at the sections highlighted in Fig.3（a）；（e）signals image at the sections highlighted in Fig.3（b）

圖3（a）是口腔上皮細(xì)胞的微分圖像，即邊緣增強(qiáng)散射光聲顯微圖像，圖3（b）是對(duì)應(yīng)的散射光聲顯微圖像，而圖3（c）則是對(duì)應(yīng)的光學(xué)顯微圖像。實(shí)驗(yàn)得到的圖像充分證明了我們提出的散射光聲微分顯微鏡系統(tǒng)不僅能獲得強(qiáng)散射弱吸收生物細(xì)胞的散射光聲圖像，圖像清晰，而且還能同時(shí)實(shí)現(xiàn)微分成像，獲取邊緣增強(qiáng)的光聲顯微圖像。從圖3（a）可以看出，微分圖像中細(xì)胞邊緣輪廓非常清晰突出，邊緣增強(qiáng)效果很好。相比于光學(xué)顯微圖像，我們得到散射光聲圖像與微分圖像的細(xì)胞結(jié)構(gòu)均與光學(xué)顯微圖像一一對(duì)應(yīng)，但由于口腔上皮細(xì)胞較為透明，一般的光學(xué)顯微鏡所成的圖像對(duì)比度很低，而我們所得到的散射光聲圖像與微分圖像均比光學(xué)顯微圖像清晰，圖像對(duì)比度高。圖3（d）和圖3（e）分別對(duì)應(yīng)圖3（a）和圖3（b）白色箭頭所表示區(qū)域的信號(hào)強(qiáng)度。由此可知，對(duì)強(qiáng)散射弱吸收樣品，應(yīng)用散射光聲微分顯微成像技術(shù)比起散射光聲顯微成像能獲得的邊緣增強(qiáng)效果。

4　結(jié)論

利用散射光聲成像技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)強(qiáng)散射樣品的光聲顯微成像，獲得高對(duì)比度的光聲顯微圖像；將光聲微分技術(shù)與散射光聲技術(shù)結(jié)合，可以實(shí)現(xiàn)光聲顯微圖像的邊緣增強(qiáng)，獲得邊緣清晰的光聲顯微圖像。利用散射光聲微分成像技術(shù)實(shí)現(xiàn)了弱吸收生物細(xì)胞的光聲微分成像，獲得了邊緣清晰的弱吸收細(xì)胞的光聲顯微圖像。該技術(shù)對(duì)強(qiáng)散射弱吸收物質(zhì)的顯微成像具有重要意義，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)⒂泻艽蟮膽?yīng)用潛力。

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Scattering Photoacoustic Differential Microscopy of Weak Absorbing Material

HUANGMinfang1，TANG Zhilie1，2，3，WU Yongbo1，2，3
（1.School of Physics and Telecommunication Engineering，South China Normal University，Guangzhou 510006，Guangdong，China；2.Laboratory of Quantum Information Technology，South China Normal University，Guangzhou 510006，Guangdong，China；3.Guangdong Provinval Engineering Research Center for Optoelectronic Instrument，Couth China Normal University，Guangzhou 51006，Guangzhou，China）

Depending on endogenous optical absorption of sample，photoacoustic microscopy for the strong scattering weak absorbing samp le is difficult.In order to realize the photoacoustic microscopy of strong scattering weak absorbing biological samp le，and obtain the edge enhancement image，which make the photoacoustic m icroscopy technique has meaningful application value in biomedical research，this paper firstly combine the scattering photoacoustic technique with the photoacoustic differentialmicroscopy and develop a novel scattering photoacoustic differential imaging technique. This technique can not only obtain scattering photoacousticmicroscopic images of strong scattering weak absorbing biolog-ical sample，but also obtain the corresponding scattering photoacoustic differential images with clear edge.This tech-nique has important application significance in the field of biomedical research.

Photoacoustic microscopy；edge enhancement；scattering photoacoustic technique；spatial differential technique

O438

A

1007-7146（2015）03-0232-05

10.3969/j.issn.1007-7146.2015.03.004

2015-01-12；

2015-03-08

國(guó)家自然科學(xué)基金（61178086）；廣東省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（S2013020012810）

黃敏芳（1989-），女，華南師范大學(xué)物理與電信工程學(xué)院碩士研究生，主要從事光聲成像方面的學(xué)習(xí)和研究

唐志列（1963-），男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事光聲成像和激光共聚焦顯微鏡等方面的研究。（電子郵箱）tangzhl@scnu.edu.cn