謝勉 何朝生 魏慎海

轉化生長因子β（transforming growth factor β, TGF-β）是一類具有多種生物學功能的多肽類生長因子超家族，目前已發(fā)現(xiàn)5種TGF-β亞型，在哺乳類動物中有TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3三種亞型，其中，TGF-β1是人體中發(fā)現(xiàn)最多的一種亞型。TGF-β對肺癌具有雙重作用。肺癌早期TGF-β信號通路中各個成分改變都將影響TGF-β對肺癌的抑制作用，促進肺癌的發(fā)生。在肺癌晚期，由于TGF-β具備的其他功能，如刺激腫瘤血管生長，降低細胞間的粘附以及合成細胞外基質等，為肺癌的生長、轉移提供微環(huán)境，使肺癌更具侵襲性。

Smads蛋白可分為三類：第一類是受體活化Smads（receptor-activited Smads, R-Smads），包括Smad1、Smad2、Smad3、Smad5和Smad8；第二類是共有Smad（Co-Smad），即Smad4，他是TGF-β超家族信號轉導途徑中必不可少的調控轉錄的關鍵因子。第三類被稱為抑制性Smad（inhibitory Smads, I-Smads），包括Smad6和Smad7。Smads蛋白作為受體后下游信號傳遞分子，其失活或突變同樣可導致TGF-β對肺癌生長抑制作用的喪失。

我們前期實驗研究（Western blot）發(fā)現(xiàn)8株肺癌細胞株的TGF-β1、Smad2蛋白表達較正常支氣管上皮細胞增高，Smad4蛋白表達較正常支氣管上皮細胞下降，而其他Smads蛋白表達無明顯差異（結果未發(fā)表）。本研究擬采用免疫組化方法觀察非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）中TGF-β1、Smad2、Smad4蛋白的表達，以揭示TGF-β1/Smad信號傳導通路在肺癌中的變化，探討TGF-β1/Smad在肺癌發(fā)生發(fā)展中的相關機制。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 連續(xù)選取我院胸外科2003年1月-2003年12月85例行根治性肺葉切除加縱隔淋巴結清掃的初診肺癌患者；排除存在第二腫瘤患者。其中男性61例，女性24例；年齡34歲-77歲，中位年齡60歲。47例腺癌，28例鱗癌，10例腺鱗癌；I期25例，II期22例，IIIa期38例，淋巴結轉移53例，無淋巴結轉移32例；術后輔助化療患者共66例，I期13例，II期20例，IIIa期33例；2例IIIa期患者接受術后輔助放療。患者復發(fā)或轉移后接受規(guī)范化放療或靶向治療?；颊唠S訪至2009年4月1日。總生存期定義為首次手術至死亡或末次隨訪時間。隨訪5年以上，生存期4個月-74個月，83例患者完成隨訪，2例患者失訪。中位生存期36個月，尚存活17人。

1.2 免疫組化試驗

1.2.1 試劑 兔抗人TGF-β1多克隆抗體（sc-146），稀釋度為1:400；兔抗人p-Smad2/3多克隆抗體（sc-11769-R），稀釋度為1:400；兔抗人Smad4多克隆抗體（sc-7154），稀釋度為1:100，以上試劑購自Santa Cruz公司。辣根酶標記羊抗兔多聚體（pv-6001）工作液試劑盒購自北京中山公司。

1.2.2 試驗步驟 依據(jù)說明書以TGF-β1陽性的乳腺癌，Smad2、Smad4陽性的胰腺癌分別為TGF-β1、Smad2、Smad4的陽性對照，用PBS緩沖液作為陰性對照，采用sp三步法進行免疫組化檢測。具體步驟如下：組織標本常規(guī)石蠟包埋，制備4 μm切片，貼附于APES處理的載破片上，65 ℃烘烤1 h，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，3%H2O2室溫孵育10 min，以消除內源性過氧化物酶的活性；蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min，置于抗原修復液中微波爐抗原修復，使溫度保持92 ℃-98 ℃持續(xù)10 min-15 min，室溫冷卻20 min-30 min使蛋白恢復原有空間構型，PBS沖洗5 min×4次，滴加山羊血清封閉以消除電荷吸附所造成的非特異性背景染色，室溫放置30 min；加稀釋的一抗，4 ℃孵育過夜；PBS沖洗5 min×4次；滴加生物素標記二抗，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗5 min×4次；滴加辣根酶標記鏈霉卵白素，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗5 ℃×4次；DAB顯色，自來水沖洗，復染蘇木素，1%鹽酸酒精分化，封片。

1.2.3 免疫組化結果的判斷 每張切片隨機取3個高倍視野，著色部位明顯高于背景或背景不著色而細胞著色者為陽性細胞染色，以陽性腫瘤細胞比例的平均值定義為該腫瘤陽性細胞百分比。TGF-β1結果判斷參照Huang等[1]的標準：陰性為無著色癌細胞（-）；弱陽性為著色癌細胞比例小于25%（+）；中度陽性為著色癌細胞比例為25%-75%（++）；強陽性為著色癌細胞比例大于75%（+++）。Smad2、Smad4結果判斷參照Yang等[2]的標準：陰性為無著色癌細胞（-）；陽性為著色癌細胞比例為5%-30%（+）；強陽性為著色癌細胞比例大于30%（++）。以癌旁間質細胞中出現(xiàn)同上染色顆粒為癌旁組織陽性表達。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用統(tǒng)計學軟件SPSS 16.0進行數(shù)據(jù)分析，采用Pearson卡方、校正卡方檢驗或Fisher's精確檢驗。Logistic回歸分析TGF-β1、Smad2、Smad4、P分期、N分期、T分期作為獨立變量對總生存期的預測影響；首先行單因素Cox和Kaplan-Meier分析，多因素分析采用Cox比例風險回歸模型。Log-rank檢驗評價單因素生存分析結果。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 TGF-β1的表達與臨床病理的關系 TGF-β1主要定位于腫瘤細胞，陽性結果為細胞胞漿呈棕褐色（圖1A）。85例肺癌組織中，TGF-β1表達陰性為37例（43.53%），TGF-β1表達弱陽性為13例（15.29%），TGF-β1表達中度陽性為15例（17.65%），TGF-β1表達強陽性為20例（23.53%）。淋巴結轉移組（N1和N2）的TGF-β1表達率明顯高于無淋巴結轉移組（N0）（P=0.002）。III期肺癌TGF-β1表達明顯高于I期、II期（P＜0.001）。TGF-β1的表達與患者年齡、性別、組織類型以及遠處轉移復發(fā)無關（表1）。

2.2 Smad2、Smad4的表達與臨床病理的關系 Smad2主要定位于腫瘤細胞，陽性結果為細胞核呈棕褐色（圖1B）。Smad2表達陽性78例（91.76%）。Smad2的表達與各臨床病理因素無關（表1）。Smad4主要定位于腫瘤細胞，陽性結果為細胞胞漿呈棕褐色（圖1C）。Smad4表達陽性76例（89.41%）。Smad4表達陰性者肺癌分期較晚（P=0.014）（表1）。

2.3 TGF-β1、Smad2、Smad4的表達與生存期的關系TGF-β1表達陰性組的生存期與TGF-β1表達陽性組比較無統(tǒng)計學差異（P=0.294）（圖2A）。肺腺癌中，TGF-β1表達陰性組生存期長于TGF-β1表達陽性性組（P=0.038）（圖2B）。TGF-β1表達陽性組5年總生存率為25.7%；TGF-β1表達陰性組為51.6%，較TGF-β1表達陽性組明顯增加（P=0.003）（表1）。TGF-β1表達陰性組和陽性組5年無病生存率無明顯差異（P=0.124）。Smad2、Smad4的表達與5年PFS率無關。Smad2和Smad4的表達與生存期無關（Smad2P=0.409；Smad4P=0.596）（圖3）。85例肺癌單因素分析顯示淋巴結轉移（P=0.001）和肺癌分期（P=0.001）與預后有關，多因素分析顯示淋巴結轉移（P=0.001）為獨立的預后因素（表2）。47例肺腺癌多因素分析顯示TGF-β1（P=0.032）和N分期（P=0.028）為獨立的預后因素（表3）。

表1 85例非小細胞肺癌患者的TGF-β1、Smad2和Smad4表達與臨床病理指標的關系Tab1 The correlationship between the expressions of TGF-β1, Smad2, Smad4 and clinicopathological characteristics in 85 NSCLC patients

圖1 非小細胞肺癌TGF-β1、Smad2和Smad4的表達。A：肺鱗癌表達TGF-β1，呈細胞漿陽性（SP，×200）；B：肺腺癌表達Smad2，呈細胞核陽性（SP，×200）；C：肺鱗癌表達Smad4，呈細胞漿陽性（SP，×400）；D：陰性對照（SP，×400）。Fig1 TGF-β1, Smad2, and Smad4 expression in non-small cell lung cancer. A: TGF-β1 expression in lung squamous carcinoma(cellular localization in cytoplasm) (×200); B: Smad2 expression in lung adenocarcinoma (cellular localization in nucleus) (×200); C: Smad4 expression in lung squamous carcinoma (cellular localization in cytoplasm) (×400); D: Negative control (×400).

圖2 NSCLC患者TGF-β1表達陰性組和陽性組的生存曲線。A：NSCLC患者TGF-β1表達陰性組和陽性組的生存曲線；B：肺腺癌患者TGF-β1表達陰性組和陽性組的生存曲線。Fig2 Influence of TGF-β1 expression on overall survival. A: Influence of TGF-β1 expression on overall survival in NSCLC patients (Kaplan-Meier multivariate analysis); B: Influence of TGF-β1 expression on overall survival in lung adenocarcinoma patients (Kaplan-Meier multivariate analysis).

圖3 NSCLC患者Smad2和Smad4表達陰性組和陽性組的生存曲線。A：NSCLC患者Smad2表達陰性組和陽性組的生存曲線；B：NSCLC患者Smad4表達陰性組和陽性組的生存曲線。Fig3 Influence of Smad2 and Smad4 expression on overall survival. A : Influence of Smad2 expression on overall survival in NSCLC patients(Kaplan-Meier multivariate analysis); B: Influence of Smad4 expression on overall survival in NSCLC patients (Kaplan-Meier multivariate analysis).

3 討論

TGF-β/Smad信號轉導途徑在參與腫瘤形成過程中發(fā)揮重要作用。TGF-β在腫瘤細胞中過度表達不僅通過刺激血管發(fā)生及其潛在的免疫抑制作用促進腫瘤發(fā)展，而且能夠直接影響腫瘤細胞的浸潤和轉移。TGF-β對腫瘤的直接影響可以通過Smads依賴途徑或干擾Smads依賴途徑介導完成。TGF-β1能誘導c-sis的表達，但抑制c-myc的表達，這種誘導或抑制作用與作用細胞種類及TGF-β的不同功能有關。TGF-β1的自分泌作用在較晚期的腫瘤中受到抑制，減弱了對原癌基因c-myc的抑制作用，加速腫瘤細胞從G1期進入S期，促進腫瘤細胞的增殖[3]。我們的研究表明TGF-β1陽性表達與肺癌分期較晚和淋巴結轉移有關，85例NSCLC中TGF-β1表達陽性率為56.47%，III期肺癌TGF-β1表達明顯高于I期、II期（P＜0.001）。Hasegawa等[4]采用酶聯(lián)免疫吸附方法實驗亦發(fā)現(xiàn)III期NSCLC患者TGF-β1蛋白水平明顯高于I期、II期的患者。

Smad2是TGFβ抗增殖應答和調節(jié)轉錄的重要級聯(lián)分子，是TGFβ-Smad信號通路中關鍵轉導分子之一，其生物活性改變將會影響通路功能，引起細胞周期或細胞表型的改變[5-7]。在TGFβ-Smad信號通路中任一因子失活均可干擾TGFβ-Smad信號轉導通路功能，導致細胞生物行為變化。本研究結果顯示在NSCLC中Smad2表達陽性者分期相對較早，但差異無統(tǒng)計學意義，Smad4表達陽性者肺癌分期較早（P=0.009），說明Smad蛋白可能充當腫瘤抑制因子，另外一些癌基因蛋白通過與Smad蛋白相作用抑制Smad蛋白的功能[8]。腫瘤細胞可以選擇性逃逸信號誘導的增長抑制或凋亡反應，TGF-β1這些對腫瘤的直接影響都是通過Smads蛋白自主的途徑所介導，或通過干擾Smads依賴的途徑而作用的。TGF-β1介導的生長抑制功能可被顯性失活的Smad2、Smad3或Smad4全部抑制。Nye等[7]考察了人肺癌中分離到的6個Smad2和Smad4突變子的生物學和生物化學功能，發(fā)現(xiàn)由于不能同野生型Smads形成同源和（或）異源寡聚物，Smad2和Smad4的所有突變體均在TGF-β轉導的轉化生長抑制信號中缺失，且不能活化由Smad/hFSAT-1介導的轉錄，結果提示Smads突變體之間不能形成功能性配對，這些異?？赡茉谀[瘤發(fā)生中起作用。

表2 85例非小細胞肺癌患者總生存期的多因素分析Tab2 Kaplan-Meier multivariate survival analysis in 85 NSCLC patients

表3 47例肺腺癌患者總生存期的多因素分析Tab3 Kaplan-Meier multivariate survival analysis in 47 adenocarcinoma patients

目前尚無文獻報道SMAD蛋白的表達與肺癌預后的關系。本研究中多因素分析顯示Smad2和Smad4表達與生存期無關，而TGF-β1是可切除肺腺癌術后獨立預后因素。Liu等[9]發(fā)現(xiàn)TGF-β1與NSCLC分化差有關，影響肺癌進展和轉移，可作為NSCLC預后指標之一。Yang等[10]發(fā)現(xiàn)肺腺癌高TGF-β1表達組（≥289 pg/mL） 比低TGF-β1表達組（＜289 pg/mL）的總生存期短。Takanami等[11]用免疫組化方法檢測120例肺腺癌組織TGF-β1的表達，結果顯示TGF-β1陰性表達組生存期比陽性表達組延長，對96例完全切除的肺腺癌病例行Cox回歸分析表明TGF-β1表達水平和肺癌分期是生存期的獨立預后因素。TGF-β1在腫瘤中可誘導表達VEGF、金屬蛋白酶（matrix metallopeptidase 2, MMP-2）和MMP-9，負調控MMP抑制因子，提供蛋白酶豐富的微環(huán)境，有利于腫瘤細胞的遷移和浸潤適當?shù)难苌掀ぜ毎鸞12]。腫瘤細胞分泌的TGF-β1能幫助瘤細胞逃避宿主免疫系統(tǒng)的監(jiān)控，易化侵襲和轉移過程[13]。TGF-β1是細胞外基質產(chǎn)生和沉積的重要調節(jié)因子。體外試驗[14]發(fā)現(xiàn)TGF-β1通過調控內皮細胞的基因表達，通過增加包括膠原蛋白、纖維蛋白在內的細胞外基質的形成和聚集導致了肺腺癌中心纖維化的形成，并且也發(fā)現(xiàn)肺腺癌中心纖維化的形成與肺腺癌的預后有關。

TGF-β1/Smads在肺癌中與其他信號系統(tǒng)如BMP/BMPR2和Wnt/β-catenin等存在相互交聯(lián)，我們仍需行進一步基礎研究闡述TGF-β在肺癌中的詳細作用機制。本研究是回顧性單純病例研究，只選擇能根治性切除的NSCLC作為研究對象，雖然患者在復發(fā)轉移后均接受規(guī)范化放療或靶向治療，但是并非所有患者在病情進展的后續(xù)治療仍存在異質性；因此本研究存在一定的偏倚。關于肺癌手術后復發(fā)轉移后多種治療方式的先后順序存在爭議[16]，是否影響總生存期尚不確定。我們將擴大研究病例群體，進一步驗證本研究的初步結果。