王星星 董雨桐 梁婷婷 張雄基 馬克威 崔永生

肺癌的發(fā)生率在惡性腫瘤中居于首位，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）約占80%[1,2]。腺癌是NSCLC中常見的病理類型，在肺腺癌患者中，伴表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）突變的患者約占15%-20%[3,4]，而中國(guó)肺腺癌患者中，EGFR的突變率更高，約為31.6%-50.7%[5,6]。EGFR突變主要見于酪氨酸激酶編碼區(qū)外顯子18-21之間，其中46%為外顯子19的ELREA氨基酸序列缺失，35%-45%為外顯子21的L858R突變[7,8]，這兩種突變是對(duì)小分子酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors, TKIs）敏感的突變類型，伴敏感突變的NSCLC患者應(yīng)用TKIs的臨床有效率為62%-83%[9-12]。而外顯子21的L861Q突變僅占EGFR突變的1.12%[3]，且對(duì)TKIs的敏感性相對(duì)較低[3,13,14]。在國(guó)際上，關(guān)于TKIs治療晚期NSCLC伴EGFR-L861Q突變患者的案例鮮有報(bào)道[15-20]。化療是NSCLC的傳統(tǒng)治療方法，TKIs是應(yīng)用日益廣泛的分子靶向藥物。對(duì)于存在EGFRL861Q突變的晚期肺癌患者，治療方案該如何選擇，至今仍有爭(zhēng)議。伴EGFR-L861Q突變的NSCLC是否對(duì)TKIs敏感，可能與其空間構(gòu)象的改變密切相關(guān)[21]。為研究EGFR-L861Q突變對(duì)TKIs的敏感性，我們重建野生型EGFR、敏感突變型EGFR-L858R及突變型EGFR-L861Q蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象，分析不同空間構(gòu)象對(duì)TKIs敏感性的差異。本文旨在探討晚期NSCLC伴EGFR-L861Q突變患者的最佳治療方案。

1 材料與方法

利用同源模建的方法構(gòu)建并分析野生型EGFR、敏感突變型EGFR-L858R及突變型EGFR-L861Q蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象。野生型EGFR蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象來源于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（Protein Data Bank, PDB）（ID: 2ITX）[22]。EGFR-L858R是2573位T突變?yōu)镚，使相應(yīng)位點(diǎn)的亮氨酸被精氨酸替代，EGFR-L861Q是2828位的T突變?yōu)锳，使該位點(diǎn)的亮氨酸突變?yōu)楣劝滨０罚?。我們?yīng)用Discovery Studio2.5中的Build mutants模塊，將野生型EGFR蛋白質(zhì)空間構(gòu)象中與EGFR-L858R和EGFR-L861Q突變位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的氨基酸分別用精氨酸和谷氨酰胺替換，從而構(gòu)建敏感突變型EGFR-L858R和突變型EGFR-L861Q蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象。

2 結(jié)果

2.1 空間構(gòu)象分析結(jié)果

2.1.1 敏感突變型EGFR-L858R與野生型EGFR蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象存在顯著差異 本文中空間構(gòu)象分析結(jié)果與2009年在Clin Cancer Res發(fā)表的研究[13]和2013年在J Clin Oncol發(fā)表的研究[23]結(jié)果一致。與野生型EGFR蛋白質(zhì)空間構(gòu)象相比，在EGFR-L858R蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象中，L858R突變導(dǎo)致活化環(huán)上的858位亮氨酸被精氨酸所取代，使活化環(huán)的空間構(gòu)象發(fā)生改變，從而影響了ATP磷酸結(jié)合環(huán)的空間構(gòu)象，這種改變使ATP結(jié)合口袋的裂隙增大，從而使活性結(jié)合位點(diǎn)更易于接近。

2.1.2 突變型EGFR-L861Q與野生型EGFR及敏感突變型EGFR-L858R的蛋白質(zhì)空間構(gòu)象均不完全相同 在EGFRL861Q的蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象中，L861Q突變導(dǎo)致活化環(huán)上的861位亮氨酸被谷氨酰胺所取代，使活化環(huán)的空間構(gòu)象發(fā)生改變，從而影響了ATP磷酸結(jié)合環(huán)的空間構(gòu)象。L861Q突變與L858R突變雖然都在活化環(huán)上，但兩者的突變位點(diǎn)所在位置不同，突變后導(dǎo)致的氨基酸變化也不一致，所以L861Q突變對(duì)ATP結(jié)合口袋裂隙變化的影響程度也不一樣。

2.2 臨床病例分享

2.2.1 患者資料 王XX，男，52歲，因體檢發(fā)現(xiàn)肺部占位，雙側(cè)頸部淋巴結(jié)腫大，為進(jìn)一步明確診治就診于我院。既往：無嗜煙、嗜酒史；無家族遺傳史。入院查體：右側(cè)頸部淋巴結(jié)活檢術(shù)后包扎固定，雙側(cè)頸部可觸及數(shù)枚腫大淋巴結(jié)，質(zhì)韌，觸之無疼痛感，邊界不清，最大約2 cm×1 cm，余未見明顯異常。標(biāo)準(zhǔn)體力狀況評(píng)分（Easten Cooperative Oncology Group, ECOG）為1分，全面評(píng)估后，明確診斷為右肺肺癌（腺型，cT3N3M1，IV期）、骨轉(zhuǎn)移癌（T10）。EGFR基因突變檢測(cè)結(jié)果回報(bào)：EGFR基因第21號(hào)外顯子檢測(cè)到點(diǎn)突變（L861Q）（圖3）。

圖1 野生型EGFR和EGFR-L858R蛋白質(zhì)空間構(gòu)象。A：野生型EGFR蛋白質(zhì)空間構(gòu)象；B：突變型EGFR-L858R蛋白質(zhì)空間構(gòu)象，兩者有明顯差異；C、D：突變位點(diǎn)的局部空間結(jié)構(gòu)；圖中箭頭所指的黃色圈內(nèi)為TKIs結(jié)合區(qū)，白色圈內(nèi)為突變位點(diǎn)的空間結(jié)構(gòu)。Fig1 The structure of wild type EGFR and activating mutant EGFR-L858R. A: The structure of wild type EGFR; B: The structure of activating mutant EGFR-L858R, they had notable distinction;C, D: The structure of mutation site. The yellow circle was the TKIs binding region, the white circle was the structure of the mutation site. TKI: tyrosine kinase inhibitor.

圖2 野生型EGFR和EGFR-L861Q蛋白質(zhì)空間構(gòu)象。A：野生型EGFR蛋白質(zhì)空間構(gòu)象；B：突變型EGFR-L861Q蛋白質(zhì)空間構(gòu)象，兩者存在一定的差異；C、D：突變位點(diǎn)及周圍的局部空間結(jié)構(gòu)，圖中箭頭所指藍(lán)色圈為TKIs結(jié)合區(qū)，箭頭所指紅色圈內(nèi)為空間構(gòu)象存在差異與否的部位。N-lobe為氨基端小葉，C-lobe為羥基端小葉，P-loop為ATP磷酸結(jié)合環(huán)，A-loop為活化環(huán)，是酪氨酸的活化中心。Fig2 The structure of wild type EGFR and mutant EGFR-L861Q. A: The structure of wild type EGFR; B: The structure mutant EGFRL861Q, they had some distinction; C, D: The structure of mutation site.The blue circle was the TKIs binding region, the red circle was the different part of the structure. N-lobe was amino-terminal leaflet, C-lobe was hydroxylterminal leaflet, P-loop was ATP phosphate binding loop, A-loop was activation loop,which was tyrosine activation center.

2.2.2 治療及療效 治療方案：患者分期為IV期，伴EGFRL861Q突變，已無外科手術(shù)機(jī)會(huì)，首選治療手段為化療或分子靶向治療。根據(jù)前期同源模建分析比對(duì)結(jié)果，我們首先選擇培美曲塞聯(lián)合順鉑（力比泰1,000 mg d1+順鉑40 mg d2-d4）作為一線治療方案，21 d為一個(gè)周期。每2周期進(jìn)行療效評(píng)價(jià)，療效評(píng)價(jià)為持續(xù)部分緩解（partial response, PR）（圖4A-圖4C）。序貫應(yīng)用分子靶向藥物-鹽酸?？颂婺峋S持治療，30 d后復(fù)查肺計(jì)算機(jī)斷層掃描（computed tomography, CT）（圖4D），肺部病灶大小較前（第4療程后復(fù)查肺CT）進(jìn)一步縮小（肺部病灶由2.3 cm×1.7 cm縮小至2.0 cm×1.5 cm）。后定期復(fù)查肺CT、腦CT、腹部CT及骨掃描提示病情穩(wěn)定，2014年4月復(fù)查時(shí)發(fā)現(xiàn)疾病進(jìn)展。

圖3 活檢組織病理及基因突變檢測(cè)結(jié)果。A：淋巴結(jié)活檢結(jié)果：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性腺癌（HE染色，×200）；B：腫瘤組織基因檢測(cè)結(jié)果：21號(hào)外顯子點(diǎn)突變（L861Q）。樣本信號(hào)曲線升起（呈S型曲線）表示該位點(diǎn)突變陽性；C：2013年4月14日肺CT，箭頭所指為T10，顯示T10骨轉(zhuǎn)移部位；D：骨掃描結(jié)果，箭頭所指為T10，顯示放射性增高。Fig3 Pathological result of lymph node biopsy and detection result of gene mutation. A: Pathological result of lymph node biopsy: Lymph node metastasis of adenocarcinoma; B: Exon 21 point mutation (L861Q). The sample signal curve rises (S-shaped curve) indicates that the mutation positive; C: Chest computed tomography scan of April 14, 2013, the arrow pointed to the position of bone metastasis of T10; D: The result of bone scan,the arrow pointed to the T10, which showed enhanced radioactivity.

3 討論

小分子靶向藥物在肺癌治療中的地位日益突顯，EGFR已成為肺癌治療的重要靶點(diǎn)[24-26]。Lynch等[8]和Paez等[27]首次報(bào)道，對(duì)于NSCLC患者EGFR酪氨酸激酶編碼區(qū)基因突變狀態(tài)是預(yù)測(cè)靶向藥物療效的一個(gè)必要前提條件。EGFR基因突變較常見于18-21號(hào)外顯子區(qū)域，其中46%為外顯子19的ELREA氨基酸序列缺失，35%-45%為21號(hào)外顯子突變（L858R替代突變）[7,8]，這兩種突變均為敏感突變。對(duì)于伴敏感突變的亞裔NSCLC患者，應(yīng)用TKIs作為一線治療的療效明顯優(yōu)于化療[28]。

EGFR-L861Q突變僅占EGFR突變陽性的1.12%[3]，是由2828位點(diǎn)的T被A取代所致。臨床上觀察到：與NSCLC伴EGFR敏感突變位點(diǎn)的患者相比，NSCLC伴EGFRL861Q突變患者對(duì)TKIs藥物的敏感性相對(duì)較低[3,13,14]。Paez等[27]在Science雜志發(fā)表的實(shí)驗(yàn)結(jié)果指出，不同位點(diǎn)突變導(dǎo)致的空間構(gòu)象改變與TKIs療效密切相關(guān)，敏感突變對(duì)TKIs的敏感性要比野生型強(qiáng)100倍。這可能是因?yàn)榭臻g構(gòu)象與激酶活性密切相關(guān)，空間構(gòu)象的改變影響了激酶的活性。既往Yun等[29]在Cancer Cell發(fā)表的研究提示，L861Q突變使861位的亮氨酸突變?yōu)楣劝滨０罚劝滨０返囊粭l側(cè)鏈帶有較大的電荷使其不易被EGFR-L861Q的非活性空間構(gòu)象所容納，而易被其活性構(gòu)象所容納。這種改變?cè)谝欢ǔ潭壬显黾恿死野彼峒っ傅幕钚?，使TKIs易于與之結(jié)合，但與EGFR-L858R相比，其激酶活性的增加程度仍有較大差異。本文的空間構(gòu)象進(jìn)行分析結(jié)果顯示，突變型EGFR-L861Q與野生型EGFR及敏感突變型EGFR-L858R的蛋白質(zhì)空間構(gòu)象均不完全相同。這提示EGFR-L861Q對(duì)TKIs的敏感性可能與EGFR-L858R不同，原因可能是L858R突變與L861Q突變雖然都在活化環(huán)上，但兩者在活化環(huán)的位點(diǎn)不同，突變后導(dǎo)致的氨基酸變化也不同，所以突變后引起的空間構(gòu)象變化也存在一定的差異。L861Q與L858R突變后引起空間構(gòu)象的變化不同，對(duì)酪氨酸激酶活性的影響也不相同。2009年在Clin Cancer Res發(fā)表的研究[13]和在J Clin Oncol發(fā)表的研究[23]通過比較野生型EGFR和ATP類似物AMPPNP結(jié)合物與敏感突變型EGFRL858R和AMPPNP結(jié)合物的空間構(gòu)象，得出如下結(jié)論：與野生型EGFR-AMPPNP結(jié)合物的空間構(gòu)象相比，EGFRL858R-AMPPNP結(jié)合物的空間構(gòu)象中ATP結(jié)合口袋的裂隙增大，這使活性結(jié)合位點(diǎn)更易于接近。這種改變可能是敏感突變型EGFR-L858R對(duì)TKIs敏感性較高的原因。但長(zhǎng)期以來，由于NSCLC伴EGFR-L861Q突變的患者比較少見，對(duì)于該類患者，治療方案該如何選擇，仍無統(tǒng)一意見。

圖4 不同時(shí)期的肺部CT。A：治療前肺部CT（2013年4月14日）；B：第2療程化療后肺部CT（2013年6月15日）；C：第4療程化療后肺部CT（2013年7月17日）；D：應(yīng)用靶向藥物維持治療30天后肺部CT（2013年8月14日）。圖中箭頭所指為肺部腫瘤。Fig4 The pulmonary computed tomography (CT) of different time. A: The pulmonary CT before treatment (April 14, 2013); B: The pulmonary CT after the second course of chemotherapy (June 5, 2013); C: The pulmonary CT after the fourth course of chemotherapy (July 17, 2013); D: The pulmonary CT after applying TKIs 30 days (August 14, 2013). The arrow pointed to pulmonary lesions.

對(duì)于晚期伴EGFR-L861Q突變的NSCLC患者一線治療該如何選擇至今仍沒有確切的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。2014年歐洲臨床腫瘤協(xié)會(huì)年會(huì)（European Society for Medical Oncology, ESMO）上也有研究提示伴EGFR-L861Q突變的NSCLC患者，應(yīng)用TKIs的客觀緩解率為39.6%，疾病控制率為75.5%，其療效與應(yīng)用化療的療效相近。因此，對(duì)于該例伴EGFR-L861Q突變的NSCLC患者，可以選擇化療作為一線治療。

有研究[30,31]證實(shí)對(duì)于晚期腫瘤患者，一線治療后應(yīng)用藥物維持治療能明顯改善患者預(yù)后。對(duì)于伴EGFRL861Q突變的晚期NSCLC患者應(yīng)該選擇什么藥物用于維持治療，至今仍有爭(zhēng)議。2011年在美國(guó)芝加哥召開的美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)（American Society of Clinical Oncology,ASCO）會(huì)議上張力教授公布了關(guān)于晚期NSCLC一線化療后維持治療的INFORM研究結(jié)果，并于2012年在Lancet Oncol發(fā)表了相關(guān)研究[31]，該研究提示：基因突變患者應(yīng)用吉非替尼維持治療與應(yīng)用安慰劑維持治療的中位無進(jìn)展生存期（progression free survival, PFS）存在明顯差異（16.6個(gè)月vs2.8個(gè)月，HR=0.17，P=0.006,3），無基因突變患者吉非替尼組與安慰劑組的PFS無明顯差異（2.7個(gè)月vs1.5個(gè)月，HR=0.86），且該研究中的基因突變組包括敏感突變和少見突變。該研究結(jié)果提示對(duì)于存在EGFR突變的晚期NSCLC患者，一線化療達(dá)到疾病控制后應(yīng)用TKIs維持治療是能夠獲益的。Giovannetti等[32]曾在分子藥理學(xué)雜志發(fā)的研究提示，這種治療模式能夠增加療效的原因可能與化療后由于某種原因增加了細(xì)胞EGFR磷酸化水平而降低了Akt磷酸化水平有關(guān)。雖然有研究[30,33]證實(shí)，對(duì)于晚期NSCLC患者，一線化療病情控制后應(yīng)用化療藥物維持治療可以延長(zhǎng)其PFS，但會(huì)增加血液毒性相關(guān)不良事件的發(fā)生率。因此，該例伴EGFR-L861Q突變的晚期NSCLC患者，一線化療后達(dá)到疾病控制后，我們選用TKIs用于維持治療，并獲得了令人滿意的臨床療效，其PFS達(dá)8個(gè)月，介于INFORM研究中一線化療后應(yīng)用靶向藥物維持治療的基因突變組和無基因突變組的PFS之間。這種治療模式使患者獲益的機(jī)制有待于進(jìn)一步的基礎(chǔ)研究。

既往研究顯示空間構(gòu)象對(duì)TKIs的療效有一定的預(yù)測(cè)作用。本文構(gòu)象分析結(jié)果顯示少見突變型EGFR-L861Q與敏感突變型EGFR-L858R及野生型EGFR的蛋白質(zhì)空間構(gòu)象均不完全相同，提示伴EGFR-L861Q對(duì)TKIs的敏感性可能與野生型EGFR并不相同。2014年ESMO會(huì)議上有研究報(bào)道，伴EGFR-L861Q突變的NSCLC患者一線應(yīng)用TKIs的療效與化療相近。文中報(bào)道的該例伴EGFR-L861Q突變的晚期NSCLC患者，當(dāng)一線化療4療程后，腫瘤不再縮小時(shí)，應(yīng)用TKIs維持治療PFS達(dá)8個(gè)月，總體臨床療效尚令人滿意。因此，對(duì)于晚期NSCLC伴EGFR-L861Q突變的患者，一線化療后達(dá)到疾病控制時(shí)，改用TKIs維持治療，可能獲得令人滿意的臨床療效?？臻g構(gòu)象與TKIs的療效可能有一定的相關(guān)性，而對(duì)于晚期NSCLC伴EGFR-L861Q突變患者的最佳治療模式，有待于進(jìn)一步臨床觀察及研究，我們期待更多、更大規(guī)模的臨床研究數(shù)據(jù)以及更深入的、基礎(chǔ)性的機(jī)制研究，使其更為明朗。