劉師偉，王明明，王 軍，樓曉華，董艷婷，張 麗，趙術(shù)君，何玉潔

(1.山西醫(yī)科大學(xué)附屬大醫(yī)院內(nèi)分泌科，山西太原030032;2.山西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，山西太原030001;3.休斯敦Methodist代謝研究中心，休斯敦德克薩斯州美國77030;4.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，山西太原030001)

胰島素抵抗是一個(gè)慢性亞臨床炎性反應(yīng)過程，二者相互促動(dòng)，引起機(jī)體內(nèi)環(huán)境的改變［1-2］。炎性反應(yīng)過程中分泌的大量炎性因子可干擾胰島素的生理作用，影響機(jī)體的能量攝入、存儲(chǔ)和代謝，促進(jìn)胰島素抵抗的發(fā)生。Vaspin是從OLETF大鼠內(nèi)臟脂肪組織中分離出來的一種具有胰島素增敏和抗感染效應(yīng)的脂肪細(xì)胞因子。用Vaspin干預(yù)高糖及高脂誘導(dǎo)的肥胖ICR小鼠后，胰島素抵抗改善，增加糖耐量，并且與胰島素抵抗相關(guān)的基因(如瘦素、抵抗素和 TNF-α 等)表達(dá)下降［3］。

本研究探討Vaspin對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)TNF-α介導(dǎo)的NF-κB和PI3K/Akt信號(hào)通路的影響，及在血管內(nèi)皮細(xì)胞中Vaspin作用于與肥胖相關(guān)的炎性反應(yīng)及胰島素抵抗的機(jī)制。

1 材料與方法:

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料

重組人Vaspin(Leinco Technologies公司);重組人TNF-α(Biovision公司);NF-κB熒光酶報(bào)告質(zhì)粒pGL4.32［luc2P/NF-κB-RE/Hygro］(Promega 公司);羊抗人ICAM-1一抗、羊抗人VCAM-1一抗、鼠抗人Akt一抗、鼠抗人磷酸化Akt一抗、IL-1和IL-6 ELISA試劑盒(R＆D Systems公司);鼠抗人MCP-1一抗(Gen Scipt公司);鼠抗人β-actin一抗(Sigma公司);HRP標(biāo)記的鼠抗羊二抗和羊抗鼠二抗(Santa Cruz公司);Trizol試劑(Invitrogen公司);SYBR Green Master Mix反應(yīng)試劑盒(Applied Biosystems公司)。

1.2 方法

1.2.1 原代HUVECs的培養(yǎng):HUVECs取自新生兒臍帶。用0.1% Ⅰ型膠原蛋白酶溶液分離內(nèi)皮細(xì)胞，將分離好的內(nèi)皮細(xì)胞接種到鋪有明膠的25 cm2培養(yǎng)瓶中，加入含20%胎牛血清、ECGS、肝素、1×105U/L青霉素-100 mg/L鏈霉素的M199培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞匯合80%以上時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和NF-κB熒光酶活力的測定:將2.5×105/mL的70% ～80%匯合的HUVECs接種于直徑 6 cm的培養(yǎng)皿，用 1.5 μL lipofectamine 2000、0.6 μg NF-κB 熒光酶報(bào)告質(zhì)粒 pNF-κB-Luc和0.5 μg β-gal質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中保溫6 h。作用6 h之后，更換含有血清的正常完全培養(yǎng)基，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中，24 h后用不同濃度(0～320 μg/L)Vaspin干預(yù)8 h，然后用10 μg/L TNF-α繼續(xù)培養(yǎng)4 h。最后用熒光素酶發(fā)光儀測定系統(tǒng)測定NF-κB熒光素酶活力。

1.2.3 Western blot分析:用0～320 μg/L Vaspin 預(yù)培養(yǎng)HUVEC 8 h，接著用10 μg/L TNF-α作用4 h后，采用Western blot檢測磷酸化的Akt以及ICAM-1、VCAM-1和MCP-1蛋白的表達(dá)水平。取細(xì)胞加蛋白提取液，加樣品電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉和加相應(yīng)一抗孵育，4℃過夜，再用HRP標(biāo)記的二抗孵育1 h。用含0.05%Tween的PBS緩沖液漂洗膜3次，ECL化學(xué)發(fā)光后用Western blot檢測系統(tǒng)檢測。數(shù)據(jù)用Gel-Pro分析軟件進(jìn)行分析。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR:用0～320 μg/L Vaspin培養(yǎng)HUVECs 8 h 后，再加入10 μg/L TNF-α 繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用 real-time PCR檢測下游分子 ICAM-1、VCAM-1及MCP-1的mRNA的表達(dá)水平。用Trizol試劑按說明書提取HUVECs的總RNA。采用SuperScript First-Strand Synthesis System 將各5 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。實(shí)驗(yàn)使用SYBR Green Master Mix反應(yīng)試劑，反應(yīng)在ABI 7500 real-time PCR系統(tǒng)完成。PCR總反應(yīng)條件為:50℃ 2 min，95℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，循環(huán)40次，72℃10 min。延伸階段檢測熒光。數(shù)據(jù)由 ABI Prism 7000 SDS軟件分析。引物序列見表1。

表1 Real-time PCR引物序列Table 1 Primer sequences for real-time PCR

1.2.5 酶聯(lián)免疫分析(ELISA):用0～320 μg/L Vaspin 預(yù)培養(yǎng) HUVECs 8 h，再用10 μg/L TNF-α 作用4 h后，用ELISA試劑盒檢測經(jīng)Vaspin和TNF-α處理后的HUVECs上清液中NF-κB下游炎性因子IL-1和IL-6的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示，組間比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 Vaspin對 TNF-α作用下HUVECs中 Akt磷酸化的影響

與對照組相比，Vaspin干預(yù)組中磷酸化的Akt水平呈劑量依賴性增加(P＜0.05)(圖1)。

2.2 Vaspin對 TNF-α作用下 HUVECs中 NF-κB熒光酶活力的影響

與對照組相比，Vaspin干預(yù)組中NF-κB熒光酶活力呈劑量依賴性被抑制(P＜0.05)(圖2)。

2.3 Vaspin對TNF-α作用下HUVECs上清液中炎性因子IL-1和IL-6表達(dá)的影響

與對照組相比，Vaspin干預(yù)組中IL-1和IL-6的表達(dá)呈劑量依賴性下降(P＜0.05)(圖3)。

圖1 在HUVECs中Vaspin對TNF-α介導(dǎo)的Akt磷酸化的影響Fig 1 Effects of Vaspin on TNF-α-induced phosphorylation of Akt in HUVECs ± s，n=3)

圖2 在HUVECs中Vaspin對TNF-α介導(dǎo)的NF-κB熒光酶活力的影響Fig 2 Effects of Vaspin on TNF-α-induced NF-κB activity in HUVECs± s，n=3)

2.4 Vaspin對TNF-α作用下HUVECs中ICAM-1、VCAM-1和MCP-1表達(dá)的影響

與對照組相比，Vaspin干預(yù)組中 ICAM-1、VCAM-1和MCP-1的mRNA和蛋白表達(dá)呈劑量依賴性被抑制(P＜0.05)(圖4，5)。

3 討論

圖3 在HUVECs中Vaspin對TNF-α介導(dǎo)的炎性因子表達(dá)的影響Fig 3 Effects of Vaspin on TNF-α-induced expression of inflammatory cytokines in HUVECs± s，n=3)

圖4 在HUVECs中Vaspin對TNF-α介導(dǎo)的ICAM-1、VCAM-1和MCP-1基因表達(dá)的影響Fig 4 Effects of Vaspin on TNF-α-induced mRNA expressions of NF-kB downstream molecules ICAM-1，VCAM-1 and MCP-1 in HUVECs s，n=3)

炎性反應(yīng)通過胰島素受體影響信號(hào)傳導(dǎo)通路IRS-1-PI3K-PKB/Akt是導(dǎo)致胰島素抵抗的主要分子機(jī)制。作為一種新的脂肪細(xì)胞因子，Vaspin具有胰島素增敏和抗感染效應(yīng)［3-6］。本研究用Vaspin干預(yù)HUVECs后，磷酸化的Akt水平增加，表明Vaspin可使血管內(nèi)皮細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)作用增強(qiáng)，可能進(jìn)一步作用于胰島素信號(hào)通路的下游分子，改善胰島抵抗，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞。但有報(bào)道Vaspin在大鼠血管平滑肌細(xì)胞可以抑制高糖誘導(dǎo)的PI3K/Akt信號(hào)通路［4］。這雖與本結(jié)果有差異，但都表明Vaspin可作用于PI3K/Akt信號(hào)通路，對血管平滑肌細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。

圖5 在HUVECs中Vaspin對TNF-α介導(dǎo)的ICAM-1、VCAM-1和MCP-1蛋白表達(dá)的影響Fig 5 Effects of Vaspin on TNF-α-induced protein levels of NF-kB downstream molecules ICAM-1，VCAM-1 and MCP-1 in HUVECs(x ±s，n=3)

本文運(yùn)用高敏感和高特異的NF-κB熒光酶報(bào)告系統(tǒng)，研究Vaspin對HUVECs中NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的影響。顯示Vaspin可明顯抑制HUVECs由TNF-α介導(dǎo)的NF-κB轉(zhuǎn)錄活性，并減輕炎性反應(yīng)。還有報(bào)道用 TNF-α處理 HUVECs 30 min后，Vaspin對NF-κB磷酸化作用不明顯［7］。本研究用 Vaspin作用于HUVECs 8 h可明顯抑制NF-κB磷酸化。

血管內(nèi)皮細(xì)胞通過調(diào)節(jié)炎性因子、黏附分子及趨化因子的表達(dá)來影響血管的功能［8］。NF-κB的激活促進(jìn)炎性因子TNF-α、IL-1和IL-6的釋放以及使血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)黏附分子ICAM-1和VCAM-1及趨化因子 MCP-1的表達(dá)增加，進(jìn)而加重血管損傷［9-10］。本研究中，Vaspin 顯著抑制 HUVECs中TNF-α介導(dǎo)的 NF-κB的活化及其下游分子 IL-1、IL-6、ICAM-1、VCAM-1及 MCP-1的表達(dá)。提示Vaspin可影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的炎性因子、黏附分子及趨化因子的表達(dá)，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)一步阻止與肥胖和胰島素抵抗相關(guān)的心血管疾病的發(fā)生。

PI3K/Akt信號(hào)在調(diào)節(jié)NF-κB的激活存在爭議。通過激活PI3K/Akt信號(hào)的傳導(dǎo)，抑制NF-κB信號(hào)的傳導(dǎo)，可以抑制炎性反應(yīng)［11-12］。也有報(bào)道抑制PI3K/Akt與NF-κB信號(hào)通路的傳導(dǎo)，同樣可發(fā)揮抗炎效應(yīng)［13］。本研究中PI3K/Akt信號(hào)通路的激活可能與NF-κB信號(hào)通路的抑制存在直接或間接的關(guān)系，對此尚需進(jìn)一步研究。

總之，Vaspin可作用于 HUVECs中 NF-κB和PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞。這對闡明Vaspin與NF-κB和PI3K/Akt信號(hào)通路在肥胖和胰島素抵抗中的機(jī)制具有重要意義。

［1］Muise ES，Azzolina B，Kuo DW，et al．Adipose fibroblast growth factor 21 is up-regulatedby peroxisome proliferatoractivated receptor gamma and altered metabolic states［J］．Mol Pharmacol，2008，74:403-412．

［2］Zulet MA，Puchau B，Navarro C，et al．Inflammatory biomarkers:the link between obesityand associated pathologies［J］．Nutr Hosp，2007，22:511-527．

［3］Hida K，Wada J，Eguchi J，et al．Visceral adipose tissuederived serine protease inhibitor:a unique insulin-sensitizing adipocytokine in obesity［J］．Proc Natl Acad Sci U S A，2005，102:10610-10615．

［4］Li H，Peng W，Zhuang J，et al．Vaspin attenuates high glucose-induced vascular smooth muscle cells proliferation and chemokinesis by inhibiting the MAPK，PI3K/Akt，and NF-κB signaling pathways ［J］．Atherosclerosis，2013，228:61-68．

［5］Blüher M．Vaspin in obesity and diabetes:pathophysiological and clinical significance［J］．Endocrine，2012，41:176-182．

［6］Liu S，Dong Y，Wang T，et al．Vaspin inhibited proinflammatory cytokine induced activation of nuclear factor-kappa B and its downstream molecules in human endothelial EA．hy926 cells［J］．Diabetes Res Clin Pract，2014，103:482-488．

［7］Fu BD，Yamawaki A，Okada M，et al．Vaspin can not inhibit TNF-α-induced inflammation of human umbilical vein endothelial cells ［J］． JVetMed Sci，2009，71:1201-1207．

［8］Tedgui A，Mallat Z．Cytokines in atherosclerosis:pathogenic and regulatory pathways［J］．Physiol Rev，2006，86:515-581．

［9］Anand AR，Bradley R，Ganju RK．LPS-induced MCP-1 expression in human microvascular endothelial cells is mediated by the tyrosine kinase，Pyk2 via the p38 MAPK/NF-kappaB-dependent pathway［J］．Mol Immunol，2009，46:962-968．

［10］ Lu Y，Zhu X，Liang GX，et al．Apelin-APJ induces ICAM-1，VCAM-1 and MCP-1 expression via NF-kappaB/JNK signal pathway in human umbilical vein endothelial cells［J］．Amino Acids，2012，43:2125-2136．

［11］Lee SH，Lee JH，Oh EY，et al．Ethanol extract of Cnidium officinale exhibits anti-inflammatory effects in BV2 microglial cells by suppressing NF-κB nuclear translocation and the activation of the PI3K/Akt signaling pathway［J］．Int J Mol Med，2013，32:876-882．

［12］Xu CQ，Liu BJ，Wu JF，et al．Icariin attenuates LPS-induced acuteinflammatory responses:involvementof PI3K/Akt and NF-kappaB signaling pathway［J］．Eur J Pharmacol，2010，642:146-153．

［13］Wang L，Xu Y，Yu Q，et al．H-RN，a novel antiangiogenic peptide derived from hepatocyte growth factor inhibits inflammation in vitro and in vivo through PI3K/AKT/IKK/NF-κB signal pathway ［J］．Biochem Pharmacol，2014，89:255-265．