張智慧 吳希蘭 應(yīng)建明 李峻嶺 邱田 郭會芹 趙煥 山靈 凌云

肺癌是世界上發(fā)病率和病死率最高的腫瘤[1]，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）約占80%，70%患者就診時已處于肺癌晚期。晚期肺癌患者預(yù)后差，采用常規(guī)化療其平均生存期小于1年[2]。近年來表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）-酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor, TKI）為NSCLC的治療帶來了希望，但是用藥前必須檢測EGFR、KRAS的突變情況，因?yàn)镋GFR野生型對TKI藥物不敏感，所以檢測基因的突變非常必要[3]。有些晚期肺癌患者的病理診斷是根據(jù)細(xì)胞學(xué)標(biāo)本做出的，如：轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)細(xì)針吸取、胸腔積液等，部分患者細(xì)胞學(xué)標(biāo)本可能是其唯一的標(biāo)本來源。能夠手術(shù)的肺癌患者檢測EGFR、KRAS基因突變采用手術(shù)后石蠟包埋組織切片標(biāo)本，但是對于不適宜手術(shù)的晚期肺癌患者其EGFR、KRAS的基因突變檢測，細(xì)胞學(xué)標(biāo)本可能是其重要來源。本研究探討細(xì)胞學(xué)細(xì)針吸取的懸浮液標(biāo)本檢測EGFR、KRAS突變的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 標(biāo)本來自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院病理科細(xì)胞學(xué)室，自2011年3月-2013年2月間，肺癌患者縱隔和體表轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)細(xì)針吸取，細(xì)胞學(xué)診斷結(jié)果為非小細(xì)胞癌（包括鱗癌和腺癌），共85例?？v隔轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)超聲內(nèi)鏡引導(dǎo)下的經(jīng)支氣管針吸活檢（endobronchial ultrasound-guided transbrochial needle aspiration, EBUS-TBNA）針吸5例，體表轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)盲穿針吸80例。其中男性45例，女性40例，年齡31歲-75歲（中位年齡54歲）。同時，19例有手術(shù)后石蠟包埋病理切片標(biāo)本作為匹配進(jìn)行EGFR、KRAS檢測，9例為肺癌原發(fā)灶標(biāo)本，10例為肺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)活檢切除標(biāo)本。13例有臨床應(yīng)用TKI抑制劑的治療效果記錄。85例均由組織病理或者免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果證實(shí)為鱗狀細(xì)胞癌4例、腺癌81例。

1.2 標(biāo)本的采集 用22 G一次性注射器（針頭規(guī)格0.7 mm）吸取淋巴結(jié)，吸出物制作傳統(tǒng)涂片和液基薄層涂片各1張用于細(xì)胞學(xué)臨床診斷，剩余在PreservCyt保存液中的懸浮液標(biāo)本留作EGFR、KRAS檢測，為了保證檢測有足夠的腫瘤細(xì)胞，并且腫瘤細(xì)胞量在70%以上，每例在基因檢測前先觀察液基薄層涂片中腫瘤細(xì)胞的數(shù)量和比例是否達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 DNA的提取 使用QIAamp? DNA mini試劑盒（Qiagen公司，德國）提取基因組DNA，操作按照使用說明書進(jìn)行。使用微量紫外分光光度計測定DNA濃度、純度。

1.4 Real-time PCR分析 使用商品化的人EGFR、KRAS基因突變檢測試劑盒（熒光PCR法）檢測EGFR、KRAS基因突變，基因突變檢測試劑盒購自北京雅康博生物科技有限公司，操作按照使用說明書進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 TKI治療的反應(yīng)率采用實(shí)體瘤評估反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行統(tǒng)計[4]。細(xì)胞學(xué)樣本和組織學(xué)樣本突變狀態(tài)的一致性，采用Cohen’s k系數(shù)進(jìn)行比較[5]. 一致性關(guān)系分為：0.81-1.00為完全一致；0.61-0.80為大體一致；0.41-0.60為中等一致[6]。

2 結(jié)果

2.1 樣本的滿意率 共檢測轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)細(xì)針吸取標(biāo)本85例，5例由于提取DNA量不足，無法進(jìn)行檢測，為不滿意標(biāo)本，其中包括EBUS-TBNA針吸2例（2/5），占40%，體表轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)盲穿針吸3例（3/80），占3.8%。3例盲穿針吸病例經(jīng)過重新吸取，補(bǔ)充細(xì)胞量，使提取DNA量充足，能夠進(jìn)行檢測，但是EBUS-TBNA針吸2例未能進(jìn)行補(bǔ)救。至此，能進(jìn)行檢測的有效標(biāo)本共83例。我們獲得了平均31.06 ng/μL的DNA。

2.2EGFR突變 檢測肺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)細(xì)針吸取標(biāo)本83例，EGFR基因突變31例，突變率為37.3%。1例同時檢測到20號和21號外顯子上2個突變點(diǎn)，另1例2個突變點(diǎn)同時位于19號和21號外顯子上。31例突變中19號、21號、20號和18號的突變率分別為51.5%（17/33）、42.5%（14/33）、3.0%（1/33）和3.0%（1/33）。19號和21號外顯子上EGFR基因的突變占94.0%。分析各外顯子突變類型，主要為第19號外顯子的缺失突變和第21號外顯子L858R點(diǎn)突變。EGFR基因突變檢測結(jié)果見圖1A和圖1B。31例突變中，2例為鱗狀細(xì)胞癌（2/4），突變率50%；29例腺癌（29/79），突變率36.7%。女性突變占女性患者的60.0%（24/40），男性突變占男性患者的16.3%（7/43）。EGFR的突變情況及突變率見表1和表2。

檢測細(xì)胞學(xué)標(biāo)本的同時，有19例福爾馬林固定石蠟包埋切片（formalin fixed paraffin-embedded, FFPE）標(biāo)本作為匹配進(jìn)行檢測。轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)活檢切除標(biāo)本10例，其結(jié)果與細(xì)針針吸標(biāo)本的檢測結(jié)果一致（kappa=1.0），9例組織學(xué)為肺部原發(fā)灶標(biāo)本，細(xì)胞學(xué)為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶標(biāo)本，同一病例原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶兩種標(biāo)本檢測結(jié)果是一致的（kappa=1.0）。

2.3KRAS突變 83例同時進(jìn)行了KRAS基因檢測，基因突變6例，主要發(fā)生在2號外顯子12和13號密碼子上的點(diǎn)突變，突變率7.2%。此6例EGFR均為野生型，未見突變。KRAS基因突變檢測結(jié)果見圖2。KRAS突變情況及突變率見表2和表3。細(xì)胞學(xué)標(biāo)本檢測有基因突變，臨床分期為IV期的13例患者，臨床上使用了TKI藥物，包括吉非替尼、?？颂婺?、厄洛替尼、阿法替尼等。連續(xù)用藥觀察，時間從5個月-36個月，臨床療效為：2例達(dá)到完全緩解（complete remission, CR）（16.7%）；8例是部分緩解（partial remission, PR）（66.7%）；3例為最佳穩(wěn)定疾?。╯table disease, SD）（25.0%），SD達(dá)到11個月-15個月。從用藥情況看，突變位點(diǎn)位于19號和21號外顯子的療效明顯，由于例數(shù)少，無法計算統(tǒng)計學(xué)意義。

表 1 EGFR的突變情況Tab 1 EGFR mutation status

表 3 KRAS的突變情況Tab 3 KRAS mutation status

圖 1 Real-time PCR檢測EGFR基因突變。A：EGFR基因野生型；B：EGFR基因突變型。Fig 1 Real-time PCR detect EGFR gene mutation. A: EGFR gene wild type; B: EGFR gene mutation type.

圖 2 Real-time PCR檢測KRAS基因突變。A：KRAS基因野生型；B：KRAS基因突變型。Fig 2 Real-time PCR detect KRAS gene mutation. A: KRAS gene wild type; B: KRAS gene mutation type.

3 討論

隨著分子生物學(xué)在臨床的應(yīng)用，基因檢測技術(shù)的成熟，分子靶向藥物在肺癌治療中的作用越來越受到重視，其療效也被臨床認(rèn)可。分子靶向藥物應(yīng)用前EGFR和KRAS基因突變的檢測，使用活檢切除或者手術(shù)后石蠟包埋切片標(biāo)本的檢測結(jié)果已經(jīng)有文獻(xiàn)報道[7-9]。細(xì)胞學(xué)漿膜腔積液石蠟包埋塊標(biāo)本，以及16 G-20 G粗針穿刺獲取標(biāo)本制成石蠟包埋塊檢測EGFR和KRAS的基因突變在國內(nèi)也有報道[10-12]。以上檢測均使用細(xì)胞石蠟包埋塊標(biāo)本。當(dāng)今臨床提倡腫瘤患者診斷和治療應(yīng)該采取損傷小，患者痛苦少的方法。尤其對于一些就診時已經(jīng)是晚期，出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，臨床應(yīng)用細(xì)針吸取獲取標(biāo)本做出診斷后，剩余懸浮液標(biāo)本能否提取DNA，進(jìn)行EGFR和KRAS基因檢測，國內(nèi)尚未見報道。對于晚期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌患者，細(xì)針吸取取材容易，創(chuàng)傷小，是其重要的標(biāo)本來源。

細(xì)胞學(xué)標(biāo)本檢測EGFR基因突變，突變率為20%-50%[11,13,14]。均采用靈敏度較高的技術(shù)進(jìn)行檢測。何臣等應(yīng)用酶切富集PCR方法，對30例NSCLC胸腔積液游離核酸EGFR基因外顯子19缺失和外顯子21 L858R突變進(jìn)行分析，30例NSCLC患者中，EGFR基因外顯子19缺失10例（33.3%），外顯子21 L858R突變5例（16.7%）。丁麗等[14]收集23例晚期NSCLC患者惡性胸腔積液，經(jīng)反復(fù)離心后取沉淀細(xì)胞行石蠟包埋，巢式PCR法擴(kuò)增外顯子19、20、21，取擴(kuò)增片段行DNA測序分析。結(jié)果顯示23例中8例發(fā)生EGFR基因突變，4例在外顯子19，2例在外顯子21，2例發(fā)生復(fù)合突變。7例突變患者服用吉非替尼治療，中位無進(jìn)展生存時間達(dá)9.5個月。王等[11]同樣采用密度梯度離心后，將21例胸水細(xì)胞包埋，制成蠟塊檢測EGFR基因突變，突變率為42.9%。以上檢測病例數(shù)均未超過50例，并且采用細(xì)胞塊包埋方法。本研究是大樣本轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)細(xì)針吸取標(biāo)本檢測EGFR和KRAS的報道，采用診斷后剩余懸浮液標(biāo)本，使用靈敏度比較高的熒光PCR方法進(jìn)行檢測，結(jié)果EGFR基因突變率為37.3%，EGFR基因突變51.5%出現(xiàn)在19號外顯子，42.5%出現(xiàn)在21號外顯子，與細(xì)胞學(xué)包埋蠟塊標(biāo)本的結(jié)果相一致。

手術(shù)切除后組織學(xué)標(biāo)本檢測EGFR基因突變率為16%-58%[15,16]，本研究突變率在37.3%。研究中19例細(xì)胞學(xué)針吸同時匹配FFPE切片標(biāo)本進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)活檢切除標(biāo)本10例，其結(jié)果與細(xì)胞學(xué)針吸標(biāo)本的檢測結(jié)果一致（kappa=1.0），說明同一病例不同取材標(biāo)本的檢測結(jié)果未存在差異。9例肺部原發(fā)灶與淋巴結(jié)針吸細(xì)胞學(xué)標(biāo)本的檢測結(jié)果也是一致的（kappa=1.0）。文獻(xiàn)報道肺部原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶不同部位EGFR檢測結(jié)果存在差異，本研究這樣的病例僅9例，由于例數(shù)少，不足以作為統(tǒng)計依據(jù)。

突變位于19號和21號外顯子，使EGFR受體激酶和對酪氨酸激酶拮抗劑的敏感性增加，癌細(xì)胞對吉非替尼的敏感性明顯增強(qiáng)[17]。細(xì)胞學(xué)結(jié)果顯示EGFR突變，無病理標(biāo)本匹配的13例臨床分期為IV期的患者，臨床給予TKI藥物進(jìn)行觀察，療效為：2例達(dá)到完全緩解CR，此2例基因突變位于19號外顯子；8例達(dá)到部分緩解PR，5個突變點(diǎn)位于19號外顯子，4個位于21號外顯子（其中1例有2個突變點(diǎn)）；3例為最佳SD，2個突變位點(diǎn)位于19號外顯子，1個位于21號外顯子，SD已經(jīng)達(dá)到11個月-15個月。

有關(guān)肺癌淋巴結(jié)細(xì)針吸取標(biāo)本提取DNA，進(jìn)行EGFR和KRAS基因突變的檢測，國外已有報道。Billah等[18]檢測166例NSCLC患者EGFR的基因突變，突變率分別是腺癌29.0%，非腺癌7.0%，KRAS為23.6%。Lozano等[19]檢測了138例NSCLC患者的原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)，EGFR突變率為17%，KRAS為12%，均發(fā)現(xiàn)EGFR和KRAS的突變是相互排斥的。其研究結(jié)果反映的是歐美群體。本研究結(jié)果83例NSCLC的EGFR突變率為37.3%，腺癌細(xì)胞為36.7%，4例鱗狀細(xì)胞癌有2例發(fā)生突變，突變率為50.0%，由于鱗狀細(xì)胞癌例數(shù)少，無統(tǒng)計學(xué)意義。歐美群體EGFR的突變率低于亞洲群體，和手術(shù)后組織切片檢測結(jié)果相一致[11,13-17,20]。

EGFR和KRAS基因突變是相互排斥的，文獻(xiàn)[21,22]報道KRAS基因突變范圍為4.7%-13.0%。本研究KRAS基因突變率為7.2%，與文獻(xiàn)報道相一致，與國內(nèi)組織學(xué)標(biāo)本的檢測結(jié)果也是相符合。有報道稱KRAS突變率分別為23.6%和12%，明顯高于亞洲群體。在肺腺癌中，歐美群體EGFR的突變率低于亞洲群體，KRAS的基因突變率高于亞洲群體。EGFR突變在肺腺癌、女性患者、非吸煙及東亞人群發(fā)生率高，吉非替尼在東方人群整體生存率和緩解率明顯高于西方人群[23-25]。

目前，關(guān)于檢測EGFR、KRAS的突變狀態(tài)作為NSCLC患者TKI療效的預(yù)測指標(biāo)廣為臨床所接收，對于不能手術(shù)的肺癌患者，如何找到組織標(biāo)本的替代者逐漸成為探討熱點(diǎn)。本研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的細(xì)針吸取可能是較好的組織替代標(biāo)本，利用診斷后剩余的細(xì)胞懸液標(biāo)本進(jìn)行檢測，標(biāo)本制作簡單、方便，因而具有較高的臨床實(shí)用性，有助于晚期肺癌患者的個體化治療。