王杰 劉暢 鐘殿勝 徐東波 寧超 馬晴

表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域由18-24外顯子編碼，目前發(fā)現(xiàn)，超過90%的EGFR基因突變位于19-21外顯子[1]。其中發(fā)生在19外顯子的E746_A750缺失突變和21外顯子上的L858R點突變所占比例最多，被稱為經(jīng)典型突變[2,3]。

目前檢測EGFR突變的方法繁多，主要是以DNA分子為基礎(chǔ)的檢測技術(shù)，可以分為兩大類：普篩方法和靶向方法。普篩方法能檢測所有EGFR突變，包括已知類型突變和未知的新型變異突變，最為經(jīng)典的代表是DNA直接測序法，但因其操作繁瑣、耗時長，對取材和技術(shù)要求較高，要求樣本突變拷貝數(shù)含量大于30%，對環(huán)境和操作者有危害而限制了其在臨床中的應(yīng)用[4]。靶向方法僅能檢測目前已知的EGFR突變，對未知的少見型突變無法測出，包括，特異性探針的實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)、擴增阻滯突變系統(tǒng)（amplified refractory mutation system, ARMS）技術(shù)等[5,6]。這些方法因其價格昂貴，對實驗環(huán)境、操作人員水平及設(shè)備要求高，影響了在臨床上的廣泛推行。

2009年，Yu等[7]用抗E746_A750del突變抗體和抗L858R點突變抗體的免疫組化法檢測非小細胞肺癌（nonsmall cell lung cancer, NSCLC）標本EGFR突變，靈敏度92%，特異度99%。此后，不同研究者所得結(jié)果差異較大，靈敏度低可至24%[8]，高可達100%[9]，特異度范圍介于77%-100%[8-17]。本文通過實驗設(shè)計，旨在評價免疫組化法檢測EGFR突變的準確性。

1 材料與方法

1.1 標本資料與方法 收集天津醫(yī)科大學總醫(yī)院2010 年12月-2012 年10月收治的NSCLC患者手術(shù)切除或組織活檢標本97例，標本取材前患者未經(jīng)EGFR酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor, TKI）治療，有基本臨床資料并可隨訪病歷?；颊叩钠骄挲g63歲（34歲-86歲）；其中，男性59例，女性38例；有吸煙史者52例，無吸煙史者45例；鱗癌30例，腺癌60例，大細胞癌7例；根據(jù)2009年國際抗癌聯(lián)盟（Union for International Cancer Control, UICC）肺癌分期標準進行TNM分期，I期23例，II期23例，III期21例，IV期30例。上述標本接受EGFR突變特異性抗體的免疫組化染色，染色陽性標本繼續(xù)接受液相芯片技術(shù)檢測，驗證標本是否確實存在突變。

另收集天津醫(yī)科大學總醫(yī)院2012年2月-2013年9月經(jīng)液相芯片法檢測驗證的40例存在EGFR19或21外顯子突變的手術(shù)組織蠟塊。其中包含20例EGFR19外顯子缺失突變標本，病理資料證實均為腺癌；20例EGFR21外顯子點突變標本，病理資料證實17例為腺癌，3例為鱗癌，術(shù)前未經(jīng)EGFR-TKIs治療。上述標本接受EGFR突變特異性抗體免疫組化染色。

1.2 免疫組織化學染色步驟 切片常規(guī)二甲苯脫蠟，經(jīng)各級濃度乙醇水化。取一定量pH 6.0檸檬酸鹽緩沖液（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），加入微波盒中，醫(yī)用微波爐中火加熱切片3 min×2次進行抗原修復，涼至室溫40 min。每張切片加1滴3%H2O2，室溫下孵育10 min。加1滴稀釋倍數(shù)為1:100的第一抗體［抗E746_A750del突變單克隆兔抗體（6B6）和抗L858R突變單克隆兔抗體（43B2）；美國Cell Signaling Technology公司］，4 ℃冰箱過夜。而后加辣根酶標記的第二抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），4 ℃溫箱30 min-40 min。每張切片加1滴新鮮配制的DAB液顯色20 min，用淡蘇木素復染細胞核30 s，各級濃度乙醇快速脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。晾干后觀察。

1.3 染色評判標準 以腫瘤細胞胞膜和（或）胞漿著色為基準，在低倍率對染色的強度和染色細胞百分比進行評估，隨機觀察10個高倍視野，根據(jù)切片中陽性細胞染色強度及百分比將表達結(jié)果分為0、1+、2+、3+四個等級。0：無染色或＜10%腫瘤細胞染色；1+：10%-50%腫瘤細胞淺染或中度染色；2+：10%-50%腫瘤細胞強染；3+：＞50%腫瘤細胞任意強度染色。以0為陰性，1+、2+、3+為陽性。本結(jié)果由天津醫(yī)科大學總醫(yī)院病理科三位老師各自單獨評分，結(jié)果經(jīng)匯總，對有差異的評分經(jīng)復核商討后得到最終一致結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用卡方檢驗分析2010 年12月-2012 年10月標本的患者年齡、性別、腫瘤分期、組織類型、吸煙情況與EGFR突變?nèi)旧栃詷吮镜年P(guān)系，所有統(tǒng)計學分析均采用SPSS 16.0進行，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。對于上述染色陽性的標本，以液相芯片法結(jié)果作為金標準，計算免疫組化法染色結(jié)果的陽性預測值（positive predictive value, PPV）。對于新收集的2012年2月-2013年9月標本，以已有的液相芯片法結(jié)果作為參考標準，計算免疫組化法檢測相應(yīng)突變的靈敏度（sensitivity）。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化染色結(jié)果觀察 根據(jù)所定免疫組化染色評分標準，圖1示例了100倍鏡下染色對應(yīng)評分。0-3+分別代表各自陰性及陽性程度。

2.2 免疫組化染色陽性標本與肺癌臨床病理生理特征關(guān)系 97例NSCLC標本中，17例免疫組化染色結(jié)果為陽性，其中抗E746_A750del抗體染色陽性標本8例（8/17, 47.06%），抗L858R抗體染色陽性標本9例（9/17, 52.94%）。免疫組化法檢測EGFR突變率為17.5%（17/97）。

如表1所示，不同臨床特征的患者免疫組化染色陽性所占比例不同，女性陽性率高于男性（26.32%vs11.86%,P=0.006,44），腺癌陽性率高于其他病理類型（21.67%vs10.81%,P＜0.001），不吸煙者陽性率高于吸煙者（28.89%vs7.69%,P=0.001,75），P均小于0.05，有統(tǒng)計學意義。但臨床分期I期-II期與III期-IV期陽性率（19.57%vs15.69%,P=0.615,84），平均年齡上下陽性率（17.78%vs17.31%,P=0.551,01），無統(tǒng)計學差異。

圖 1 免疫組化染色結(jié)果示例圖片（×100）。A：3+；B：2+；C：1+；D：0.Fig 1 Different degree of immunostaining results (×100). A:3+; B: 2+; C: 1+; D: 0.

表 1 免疫組化染色陽性患者的不同臨床病理特征Tab 1 Clinicopathologic features of the patients with positive immunostaining results

2.3 染色陽性標本接受液相芯片技術(shù)檢測的結(jié)果 上述17例染色陽性的標本中，由于4例組織標本無法獲取，故最終獲得了13例標本。如表2所列，在這13例標本中，液相芯片法所測19外顯子缺失突變者5例，21外顯子點突變者5例，余3例為野生型。即在這13例免疫組化染色陽性標本中，有3例為假陽性結(jié)果（3/13, 23.1%），10例為真陽性結(jié)果（10/13, PPV=76.9%）。

按免疫組化染色陽性程度分（表3）：染色為“1+”的6例，其中假陽性結(jié)果3例（3/6, 50%），實際突變3例（3/6, PPV=50%）；染色為“2+”的3例，無假陽性結(jié)果，實際3例均突變（3/3, PPV=100%）；染色為“3+”的4例，無假陽性結(jié)果，實際4例均突變（4/4, PPV=100%）。

2.4 40例EGFR突變陽性標本的免疫組化染色結(jié)果分析 在40例液相芯片法所測EGFR19或21外顯子突變陽性標本中，兩種特異性抗體的免疫組化法染色結(jié)果為陽性的占16例，靈敏度為40%（16/40）。

在20例液相芯片法所測EGFR19外顯子缺失突變標本中，應(yīng)用抗L858R抗體檢測標本染色結(jié)果均為陰性；應(yīng)用抗E746_A750del抗體檢測標本染色結(jié)果為陽性的占9例，即該抗體的免疫組化法檢測EGFRE19缺失突變的靈敏度為45%（9/20）。

在20例液相芯片法所測EGFR21外顯子突變標本中，應(yīng)用抗E746_A750del抗體檢測標本染色結(jié)果均為陰性；應(yīng)用抗L858R抗體檢測標本染色結(jié)果為陽性的占7例，即該抗體的免疫組化法檢測EGFRE21突變的靈敏度為35%（7/20）。

3 討論

本文首先對97例NSCLC患者的手術(shù)或組織活檢標本行特異性抗體的免疫組化染色，結(jié)果示17例染色陽性，即免疫組化法檢測EGFR突變率為17.5%，與2011年Li等[18]對該院208例NSCLC患者行DNA測序所得的24.5%的EGFR突變率大體一致。EGFR突變比例在不同人種中差別較大，歐美地區(qū)NSCLC患者EGFR突變發(fā)生率約為10%-16%，亞裔NSCLC患者的EGFR突變發(fā)生率約為30%-50%[19,20]。在中國和日本不同研究者所行檢測中，EGFR突變陽性比例范圍在17.3%-58%之間[18,21-25]。另外，EGFR免疫組化染色陽性的病例易發(fā)生在女性、腺癌、不吸煙患者中（P＜0.05），與肺癌患者年齡、臨床分期等無明顯關(guān)系（P＞0.05），上述結(jié)論均與傳統(tǒng)共識相符[26-28]。進一步對上述免疫組化法染色陽性的NSCLC患者標本行液相芯片檢測技術(shù)，并以后者作為評判標準，驗證免疫組化法檢測EGFR突變的準確性。17例染色陽性的標本，除去缺失的4例，剩余13例中，液相芯片法檢測出10例EGFR突變（10/13, 76.9%），染色評分為“2+”和“3+”的標本，實際驗證均存在突變，PPV均高達100%。由此推測，免疫組化法染色評分為強陽性的標本結(jié)果可靠。

表 2 13例免疫組化染色陽性NSCLC標本的液相芯片技術(shù)檢測結(jié)果Tab 2 Thirteen cases of NSCLC samples with positive immunostaining results analyzed by liquid chip technology

表 3 免疫組化法所測EGFR突變的陽性預測值Tab 3 PPV of EGFR mutation by IHC

由于上述13例均為免疫組化染色陽性的標本，僅可算出診斷試驗的PPV，初步評價了免疫組化法預測陽性標本的準確性，因此，我們又新收集了經(jīng)液相芯片法證實為突變陽性的標本，行免疫組化染色，進一步評價免疫組化法檢出突變的靈敏度。結(jié)果示應(yīng)用抗E746_A750del抗體檢出19外顯子缺失突變的靈敏度為45%（9/20）。應(yīng)用抗L858R抗體檢出21外顯子突變的靈敏度為35%（7/20）。E746_A750del抗體檢測19外顯子缺失突變的靈敏度高于應(yīng)用L858R抗體檢測21外顯子突變的靈敏度，這與Brevet[12]、Kato[13]、Kitamura[15]、Hofman等[8]研究者的實驗結(jié)果相符，但與Kawahara[29]、Ambrosini-Spaltro[9]等的結(jié)果有差異，可見此結(jié)果目前尚難定論。

表4列舉了近些年來不同研究者行特異性抗體的IHC檢測EGFR19和21外顯子突變靈敏度的情況，對總體的檢測，從29.8%-80.4%波動范圍較大，推測影響結(jié)果的因素較多。標本類型包括組織切片和組織芯片。Ambrosini-Spaltro等[9]認為，應(yīng)用組織切片可能較組織芯片更完整顯示出腫瘤細胞免疫組化反應(yīng)情況，由此推測在其他因素相同的情況下，應(yīng)用組織切片標本所得靈敏度結(jié)果較組織芯片更為理想。但Hofman等[8]同樣應(yīng)用組織切片標本進行實驗，所得靈敏度結(jié)果仍偏低，本實驗結(jié)果介于各研究結(jié)果之間，與免疫組化法檢測EGFR突變實際情況大體相符。

表 4 不同研究者免疫組化法檢測EGFR突變靈敏度的總結(jié)Tab 4 Sensitivity of IHC in detecting EGFR mutations from different studies

對于NSCLC患者EGFR突變的檢測，相比分子水平的檢測手段，免疫組化法因其價格低廉、操作簡便、易于臨床開展而受到了人們的關(guān)注。免疫組化法染色評分為強陽性的標本結(jié)果準確，但靈敏度不甚理想，臨床推廣是否可行仍有待進一步探討。