一氧化氮對擬南芥高硼毒害的緩解

夏金嬋+何奕昆

摘要：硼是植物生長發(fā)育所必需的微量元素，當土壤中硼的含量過高時就會對植物的生長產(chǎn)生毒害，高硼脅迫能夠抑制植物的生長，降低農作物的產(chǎn)量與品質，因此研究植物抗高硼脅迫的分子機制至關重要。一氧化氮（NO）作為信號分子參與植物的生長發(fā)育及多種脅迫反應過程。研究發(fā)現(xiàn)高硼脅迫能夠誘導擬南芥內源NO含量的升高，外加NO能夠提高擬南芥對高硼脅迫的抗性，同時內源NO含量升高的突變體nox1和cue1表現(xiàn)出抗高硼脅迫的表型，而內源NO含量低的突變體noa1則表現(xiàn)出高硼處理敏感的表型，為了進一步研究NO緩解高硼對擬南芥的毒害的機制，測定在不同處理條件下擬南芥中硼的含量變化。結果表明，隨著培養(yǎng)基中硼酸含量的增加擬南芥中硼的含量也增加，而外源或者內源NO都能夠降低高硼處理條件下擬南芥中硼的含量，降低對植物的毒害。因此，高硼脅迫下降低擬南芥體內硼的含量是NO緩解高硼毒害的重要方面。

關鍵詞：擬南芥；硼；nox1/cue1突變體；noa1突變體

中圖分類號：Q945.78 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）15-3608-05

Abstract： Boron is an essential micronutrient for plants， when excessively occurs in the growth medium， it becomes toxic to plants， and inhibits plant growth and reduces the quality of crops. Therefore， it is important to research the molecular mechanism of plant resistance to high boron stress. Nitric oxide （NO） as a signaling molecule involved in plant growth and a variety of reactions to stress， and in this study， it is found that high boron induced NO synthesis in Arabidopsis. Endogenous （nox1 and cue1 mutant） or exogenous NO can improve resistance to high boron stress in Aarabidopsis， while low levels of endogenous NO mutant noa1 showed sensitive phenotype to high boron stress. To assess further the molecular mechanism， the boron content under high boron stress in Arabidopsis was measured， and it is showed that NO could decrease boron concentrations in Arabidopsis exposed to high boric acid. As a result，boron toxicity could be alleviated by nitric oxide by decreasing boron acid in Arabidopsis seedlings.

Key words： Arabidopsis；boron；nox1/cue1；noa1

硼是植物生長發(fā)育所必需的微量元素，不僅影響植物細胞壁和細胞膜的結構與穩(wěn)定[1]，而且對碳水化合物的運輸、花粉萌發(fā)和花粉管的生長[2]等方面有所作用。在農業(yè)生產(chǎn)中，土壤中硼濃度過高會影響植物的生長，降低作物的產(chǎn)量和品質，是農業(yè)生產(chǎn)中的重要問題[3]。由于硼元素的特殊化學性質，既沒有氧化還原能力，也不構成酶的組成部分，因此人們對硼的認識是從缺硼的生理試驗中推論獲得的，對其的了解遠不如其他營養(yǎng)元素。在東南亞、中國東南部，因雨水帶走土壤中的硼造成硼的缺失可通過施肥彌補；而在半干旱地區(qū)，硼則會對植物造成毒害，高硼使葉片的尖部和周邊萎黃等[4]。由于適合作物生長的硼濃度范圍很窄，且硼的毒害比缺少更嚴重。因此，了解硼的吸收轉運機制對農業(yè)生產(chǎn)具有至關重要的作用[5]。土壤中硼主要以硼酸或硼酸鹽的形式存在，植物中95%的硼是以硼酸的形式存在。近來人們對硼的吸收轉運機制的研究取得了突破性進展，鑒定了某些硼的轉運通道和轉運蛋白， 例如，NIP5、NIP6、BOR1和BOR4，并對它們的轉運機制有了部分了解[6-8]。

一氧化氮（NO）是一種結構簡單、水溶性的氣體活性分子，在生物體中有重要的作用，近年發(fā)現(xiàn)，其在植物中也具有廣泛的生理效應，參與植物的生長和代謝[9]等過程。越來越多的證據(jù)表明，NO可作為一個信號分子參與眾多生理反應，如植物對干旱、鹽度、重金屬、紫外線和臭氧等非生物脅迫的反應均受NO的調節(jié)[10，11]；而且NO還參與植物對病原菌侵染的防御性反應，在植物的防御反應中，NO可以誘導抗性相關基因的表達，提高植物抵抗病原菌侵染的能力[12]。研究發(fā)現(xiàn)高硼脅迫能夠誘導擬南芥（Arabidopsis thaliana）內源NO的含量的升高，外加NO能夠提高擬南芥對高硼脅迫的抗性，同時內源NO含量升高的突變體nox1和cue1表現(xiàn)出抗高硼脅迫的表型，而內源NO含量低的突變體noa1則表現(xiàn)出高硼處理敏感的表型，為了進一步研究NO緩解高硼對擬南芥毒害的機制，測定在不同處理條件下擬南芥中硼的含量變化，結果表明，隨著培養(yǎng)基中硼酸含量的增加擬南芥中硼的含量也增加，而外源或者內源NO都能夠降低高硼處理條件下擬南芥中硼的含量，降低對植物的毒害?？梢?，高硼脅迫下降低擬南芥體內硼的含量是NO緩解高硼毒害的重要方面。

1 材料與方法

1.1 植物材料與生長條件

供試擬南芥（Arabidopsis thaliana）均為Col-0生態(tài)型背景。土壤中培養(yǎng)擬南芥時，將吸水飽和并經(jīng)4 ℃春化處理2～3 d的種子，均勻播種于用1/3 B5 營養(yǎng)液飽和的蛭石基質上。培養(yǎng)皿中無菌培養(yǎng)擬南芥的過程為：首先消毒種子表面，將適量干燥的擬南芥種子置于1.5 mL小離心管中，先用適量的70%乙醇消毒30 s，再用1 mL 10%～15%的次氯酸鈉溶液（漂白液）浸泡10～15 min，然后用無菌水漂洗3～5次，置于4 ℃同步化處理2～3 d，均勻地種在1/2 MS的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基含1/2 MS（murashige and skoog salts，Sigma M5519）、1%（W/V）蔗糖和0.8%（W/V）瓊脂（Sigma），點種后用膜將培養(yǎng)皿口封好，放在培養(yǎng)間中培養(yǎng)。高硼處理過程為：把含硼的1/2 MS培養(yǎng)基滅菌，制成高硼培養(yǎng)基，野生型和突變體在正常培養(yǎng)基上生長7 d，再移到不同濃度的高硼培養(yǎng)基上，觀察表型。培養(yǎng)間的溫度為22 ℃，光照度為100 μmol/（m2 ·s），光周期為16 h光照/8 h黑暗交替[13]。

1.2 硼含量的測定

用1/2MS培養(yǎng)基中生長10 d的野生型和突變體植物，移到含有高硼的培養(yǎng)基上處理，在指定時間取材，在60 ℃的烘箱里處理7 d使植物干燥。干燥的植物用HNO3消化。再用MS-ICP（安捷倫Agilent 7 500C）測定材料中硼離子的含量[13]。

1.3 內源NO含量的測定

高硼處理的擬南芥根部在有或者沒有NO的清除劑cPTIO[0.5 mmol/L，2-（4-carboxyphenyl）-4，4，5，5-tetramethylimidazo-line-1-oxyl-3-oxide]的情況下，在緩沖液中處理15 min （5 mmol/L MES-KOH， pH5.7，0.25 mmol/L KCl，1 mmol/L CaCl2），在15 μmol/L NO染料DAF-FM DA（4-amino-5-methylamino-2′，7′-difluorofluorescein diacetate）中處理15 min，最后在去離子水中清洗20 min，洗掉表面附著的染料。用配有CCD（charge coupled device）的熒光顯微鏡（fluorescence stereomicroscope，ZEISS Stemi SV 11），對材料發(fā)射的熒光進行記錄和分析NO的含量。激發(fā)光波長為495 nm，發(fā)射光（emission images）波長為515 nm（濾光片），采集圖像的曝光時間恒定[14]。

1.4 統(tǒng)計學分析

試驗3次重復，不同組進行司徒登t檢驗，當P<0.05時認為有顯著差異。

2 結果與分析

2.1 高硼脅迫可誘導NO的產(chǎn)生

已有證據(jù)表明，NO參與許多植物對脅迫的反應過程，但是NO是否參與了植物對高硼脅迫的反應仍不清楚。為了驗證NO是否參與植物在高硼脅迫下的反應過程，用可滲透細胞膜的NO特異性探針DAF-FM DA染色法，測定高硼脅迫下擬南芥根部內源NO含量的變化。將正常條件下生長7 d的擬南芥幼苗，轉移到含有不同濃度的硼酸培養(yǎng)基上進行高硼脅迫處理，并在不同的時間點取材，用DAF-FM DA染色法測定擬南芥根中內源NO含量的變化。圖1A表明野生型擬南芥在高硼脅迫條件下根部內源性NO的含量增加；高硼脅迫誘導擬南芥內源性NO含量的增加還表現(xiàn)出與高硼處理時間正相關的特性（圖1B）；高硼脅迫表現(xiàn)出對硼酸濃度的劑量依賴性特征，熒光強度顯示，在2 mmol/L的硼酸處理時，擬南芥內源性NO的含量約是正常條件下的2倍，在3 mmol/L的硼酸處理時，擬南芥內源性NO的含量約是正常條件下的2.5倍（圖1C）；為了驗證所檢測的熒光是由內源性NO產(chǎn)生的，用NO的清除劑cPTIO清除所檢測到的熒光，借此證明用DAF-FM DA染色顯示的熒光強度的變化。表明NO的清除劑cPTIO能夠清除高硼脅迫誘導擬南芥中所生成的NO，因此染色所得的熒光強度就反映了植物體內NO含量的變化，由于在常溫下生長的擬南芥中NO的含量變化很小，這些結果進一步說明了高硼脅迫能夠誘導NO的產(chǎn)生，并且表現(xiàn)出與高硼脅迫處理濃度與時間正相關的特征。

2.2 NO提高擬南芥對高硼脅迫的抗性作用

高硼能夠誘導NO的產(chǎn)生，那么NO是否作為信號分子參與植物的抗高硼脅迫的反應過程，能否提高植物的抗高硼脅迫的能力，為了進一步研究NO在抗高硼脅迫過程中的作用，研究了外源NO對擬南芥抗高硼脅迫能力的影響。將消毒的擬南芥種子種在含有6 mmol/L硼酸的1/2 MS培養(yǎng)基內，同時加入不同濃度的SNP（NO的供體Sodium Nitroprusside，Dihydrate），生長1個月后發(fā)現(xiàn)，在分別加入2 μmol /L SNP或者5 μmol /L SNP培養(yǎng)基中的擬南芥抗高硼脅迫的能力明顯增強，在加入SNP的培養(yǎng)基上生長的擬南芥明顯好于未加SNP的擬南芥（圖2A）。為了進一步驗證內源NO對擬南芥抗高硼脅迫能力的影響，選擇了內源NO含量高的2個突變體cue1和nox1，以及內源NO含量低的1個突變體noa1進行實驗，將消毒的野生型擬南芥和cue1、nox1、noa1突變體的種子分別種在含有3、5 mmol/L硼酸的1/2 MS培養(yǎng)基上，生長20 d后發(fā)現(xiàn)，內源NO含量高的2個突變體cue1和nox1長勢明顯比野生型好。在正常培養(yǎng)基上生長的cue1和nox1突變體根比野生型的短，而在含有3、5 mmol/L硼酸的1/2 MS培養(yǎng)基上，cue1和nox1突變體的根比野生型的長，特別是在3 mmol/L硼酸的處理條件下，野生型的生長明顯受到了抑制，而cue1和nox1突變體的生長相對比較正常，說明cue1和nox1突變體抗高硼脅迫的能力比野生型強；而內源NO含量低的突變體noa1，在正常條件下noa1的根較野生型的略長，而在含有3、5 mmol/L硼酸的1/2 MS培養(yǎng)基上，noa1突變體的根比野生型的短，即表現(xiàn)出敏感的表型，說明noa1突變體抗高硼脅迫的能力比野生型的低（圖2B）。另外發(fā)現(xiàn)，上述野生型擬南芥和3種突變體的種子，在不同濃度硼酸的培養(yǎng)基上萌發(fā)率未見明顯差異。同時測定了野生型與突變體在高硼脅迫條件下生長的根長，將在正常培養(yǎng)基上生長3 d的野生型擬南芥和cue1、nox1、noa1突變體的幼苗轉移到含有不同濃度硼酸的豎直培養(yǎng)基上進行處理，10 d后測定它們的根長發(fā)現(xiàn)硼酸可以抑制其根的生長，而內源NO含量高的2個突變體cue1和nox1在含有2、3 mmol/L硼酸的培養(yǎng)基上的根明顯比野生型的長，內源NO含量低的突變體noa1在含有2、3 mmol/L硼酸的培養(yǎng)基上的根比野生型的稍短（圖2C）。這些結果都表明NO能夠提高擬南芥對高硼脅迫的抗性，在擬南芥的抗高硼反應過程中起著至關重要的作用。

2.3 NO能夠降低高硼脅迫條件下植物體內硼的含量

以上研究表明NO能提高擬南芥對高硼毒害的抗性。為了進一步探討其調控機制，檢測了擬南芥在不同處理條件下植物體中硼含量的變化。首先檢測了高硼脅迫條件下野生型擬南芥體內硼含量的變化，結果顯示在3 mmol/L高硼處理條件下擬南芥體內硼的含量是正常條件下的11倍，這些硼對擬南芥的生長產(chǎn)生了嚴重的抑制作用，同時也表明高硼脅迫條件下擬南芥體內硼的含量是上調的（圖3A）。值得注意的是在3 mmol/L硼酸處理時的同時如果加入2.5 μmol/L的SNP，生長20 d后擬南芥中的硼含量較未加SNP的植株中硼含量減少8.7%；如果在3 mmol/L的硼酸處理條件下在培養(yǎng)基中加入5 μmol/L的SNP生長20 d，擬南芥中的硼含量比沒有加入SNP的3 mmol/L的硼酸處理條件下的擬南芥中硼含量減少12.6%（圖3B），這些結果表明外源NO能夠降低高硼處理下植物中硼離子的含量，減輕高硼脅迫對擬南芥的毒害。為了進一步驗證上面的結果，利用2個內源NO含量高的突變體cue1和nox1突變體和1個內源性NO含量低的突變體noa1，測定它們在不同硼酸處理條件下內部硼含量的變化，研究內源NO對高硼脅迫條件下擬南芥體內硼含量的影響，研究發(fā)現(xiàn)，在正常的生長條件下內源NO含量高的突變體cue1和nox1突變體幼苗中硼的含量就比野生型中的低，而內源性NO含量低的突變體noa1中硼的含量在正常生長條件下比野生型中的稍高；在不同濃度的硼酸處理條件下，cue1和nox1突變體中硼的含量也低于野生型，而突變體noa1中硼的含量稍高，與突變體內源的NO含量呈正相關（圖3C）。這可能是NO能夠提高植物對高硼抗性的重要原因。

3 討論

硼是高等植物生長發(fā)育所必需的微量元素，然而，人們對硼吸收轉運機制的了解遠遠落后于其他營養(yǎng)元素。其適合作物生長的濃度較窄，硼的過量和缺少已成為世界關注的問題，硼的缺少可以通過施肥來補充，而大量施肥造成硼的過量，將對植物造成毒害，抑制作物的生長，影響作物的品質和產(chǎn)量，因此，研究植物抗高硼脅迫的分子機制，對農業(yè)生產(chǎn)具有至關重要的作用，以期通過分子生物學手段提高作物的抗高硼脅迫的能力。

NO作為植物生長發(fā)育的一個關鍵調節(jié)因子，在植物生長、發(fā)育與環(huán)境互作的協(xié)調過程中發(fā)揮中樞性的作用，并對各種脅迫產(chǎn)生應答。研究表明，植物對干旱、高/低溫、鹽度、重金屬、損傷等脅迫的反應均受到NO的調節(jié)[15-17]。NO在調控離子穩(wěn)態(tài)和抵抗毒性離子脅迫方面也具有重要作用，研究證明，在毒性離子鎘的脅迫下，植物體產(chǎn)生NO，NO參與了植物對鎘脅迫的反應過程[18，19]。NO也可提高植物對銅脅迫的毒害[20]。研究發(fā)現(xiàn)，高硼脅迫能明顯抑制植物的生長[21，22]，野生型擬南芥在3 mmol/L硼酸的培養(yǎng)基中，根的生長被抑制了70%，地面部分的生長也受到明顯的抑制。在擬南芥中高硼脅迫能誘導NO的產(chǎn)生，外加NO的供體SNP能提高擬南芥對高硼脅迫的抗性，內源NO含量高的突變體nox1和cue1，表現(xiàn)出對高硼脅迫的不敏感表型，而內源NO含量低的突變體noa1，則表現(xiàn)出高硼脅迫敏感的表型，上述結果從外源與內源均證明NO能夠提高擬南芥對高硼脅迫的抗性。擬南芥體內硼含量的檢測結果表明，外源與內源NO都能降低擬南芥體內硼的含量，這可能是NO緩解高硼對植物毒害的重要原因。但是NO降低高硼脅迫條件下植物體中硼的含量是由于抑制了植物對硼的吸收還是增加了植物對硼的外排還需要進一步研究。另外植物在脅迫條件下一些與抗逆有關的保護基因表達量都會升高，NO提高植物抗高硼脅迫的能力是否與抗性基因的表達有關也需要進一步研究。

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