曾 涵 楊 陽 趙淑賢

(新疆師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，烏魯木齊 830054)

酶燃料電池具有對環(huán)境友好和較高能量轉(zhuǎn)化效率等優(yōu)點(diǎn)，已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。研究者們普遍認(rèn)為制約酶燃料電池性能的關(guān)鍵因素是陰極氧分子電催化還原過程[1]。漆酶(Laccase，縮寫為Lac)因其活性中心具有較高的式電位，對氧分子具有較高的親和力和高選擇催化性能，被認(rèn)為是酶燃料電池陰極的首選電化學(xué)催化劑，但Lac結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其活性中心為多肽鏈包覆，過去認(rèn)為很難實(shí)現(xiàn)電子在酶-電極之間的直接遷移[2-3]。迄今為止已有多種方法實(shí)現(xiàn)Lac分子和電極之間的直接電子遷移[4-7]，這些方法中最引入注目的就是利用納米器件表面功能化特定結(jié)構(gòu)官能團(tuán)的方法，使氧化還原基團(tuán)或與酶活性中心發(fā)生特殊相互作用的基團(tuán)靠近酶活性中心，以利于酶活性中心-電極間的直接電子遷移，考慮到Lac活性中心結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，通常使用的將葡萄糖氧化酶活性中心在電極表面重構(gòu)的方法[8]對于Lac難以實(shí)現(xiàn)。近期許多文獻(xiàn)[9-14]都指出，以具有大π共軛體系的芳香化合物修飾納米器件可以利用π-π堆積作用使酶活性中心定向排列在納米器件表面并與表面修飾的特定官能團(tuán)發(fā)生特定相互作用，利于酶-導(dǎo)電基體間的直接電子遷移。納米金粒子作為常用的固酶載體和構(gòu)筑酶基電極的導(dǎo)電基體具有很多優(yōu)點(diǎn)：導(dǎo)電性能優(yōu)異、比表面積高、粒徑可控以及表面修飾功能化基團(tuán)簡便等[15-16]，但是納米金粒子與酶分子直接接觸時，可能因?yàn)榧{米金粒子與酶活性中心附近多肽配體間的相互作用，造成酶活性中心構(gòu)型扭曲，導(dǎo)致催化活性下降甚至失活[17]。目前已有一些文獻(xiàn)報道采用芳香基團(tuán)包覆或者修飾納米金粒子表面的方法，構(gòu)筑實(shí)現(xiàn)酶-電極間直接電子遷移[18-20]，但仍有改進(jìn)的空間：制備繁瑣，成本高，時間長；由于只能固定單層或幾層實(shí)現(xiàn)導(dǎo)電的酶分子，導(dǎo)致催化性能不高(有的固定Lac電極雖可實(shí)現(xiàn)酶-電極間直接電子遷移但對底物無催化性能[19])，以及使用致癌的稠環(huán)芳烴，難于在生物體內(nèi)使用等。文獻(xiàn)報道過2種不同官能團(tuán)修飾納米金粒子的制備方法[21]，迄今為止尚未見其作為固酶載體并以之為基礎(chǔ)，制備酶基電極以及測試其性能的研究報道，只有使用氧化還原電子中介體-酶自組裝層疊層體系得到固酶電極并討論其催化氧還原性能的報道[22]?；谏鲜鏊悸?，本文分別以這兩種納米金粒子作為固酶載體和導(dǎo)電基體，制備了4種納米金粒子固酶修飾電極 (每一種納米金粒子分別固定Lac和葡萄糖氧化酶GOx)，本文提出的這類固酶載體，憑借納米金粒子表面芳香環(huán)-酶分子活性中心周圍疏水結(jié)合位間的疏水-疏水作用，使酶活性中心定向排列在納米金粒子表面；同時依靠納米金粒子表面官能團(tuán)與酶分子表面氨基酸殘基之間的相互作用，物理吸附或化學(xué)偶聯(lián)酶分子，這樣不僅將酶分子牢固地固定于電極表面，也利于實(shí)現(xiàn)酶-電極間的直接電子遷移。通過比較這兩種不同結(jié)構(gòu)納米金粒子固酶電極的直接電子遷移和催化底物反應(yīng)的性能，再結(jié)合前文和文獻(xiàn)給出的類似固酶電極的測定結(jié)果，為定性和定量分析固酶方式、電極表面固酶載體結(jié)構(gòu)和形貌等電極結(jié)構(gòu)參數(shù)對固酶電極催化性能的影響提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，結(jié)合相關(guān)理論，有可能深入分析和闡釋生物體內(nèi)神經(jīng)信號，新陳代謝等生理活動的機(jī)制。本文還以這兩種納米金粒子構(gòu)筑的固酶電極組裝了2種酶燃料電池，測試了其能量輸出性能，進(jìn)一步評估了其長期使用性，確定了影響電池性能的主要因素。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

聚聚乙烯亞胺 (PEI，Mr：7．5×105)， 聚乙烯基吡啶(PVP，Mr：6．0×104)，聚丙烯酸(PAA，Mr：2．4×105)，4-巰基苯甲酸(MBA，分析純)，巰基乙胺(分析純)，漆酶(Lac，來源于 Trametes Versicolor，Mr：6．8×104)， 葡萄糖氧化酶(GOx，Mr：～5．0×104)，2，2′-連氮-雙-(-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺 酸)-二 胺 鹽 (ABTS，98．5%)， 牛 血 清 白 蛋 白(BSA)， 四水合四氯金酸，NaBH4，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS，AR)，N-乙基-N′-(3-二甲基氨丙基) 碳二亞胺(EDC，AR)均購自美國Sigma-Aldrich化學(xué)試劑有限公司，冰乙酸，甲醇，乙醚以及配制磷酸鹽緩沖液(PBS)所需的試劑均為分析純。

Bruker Equindx-55型紅外光譜儀 (德國Bruker公司)，KBr壓片；透射電鏡照片以H-800型透射電子顯微鏡(日本日立公司，加速電壓：200 kV)拍攝；Analyst 800型原子吸收光譜儀(美國Perkin-Elmer公司，主機(jī)：雙光束火焰/石墨爐原子吸收分光光度計(jì)，光譜范圍：190～870 nm)；U-2810型紫外可見分光光度計(jì) (日本島津公司，比色皿厚度1 cm)；CHI-1140A型電化學(xué)分析儀(上海辰華儀器有限公司)，作為參比電極的Ag/AgCl(飽和KCl)電極和作為基底電極的金盤電極(GD，直徑1 mm)均購自天津艾達(dá)恒晟工貿(mào)有限公司，自制鉑絲電極作為對電極，高純氮?dú)夂透呒冄鯕赓徸阅暇┨貧?，Clark型氧電極(英國Hansatech公司)。基底金盤電極使用前先以3500#砂紙，1．0和0．5μm氧化鋁粉漿拋光，再用丙酮和三次重蒸水超聲清洗各2次，每次2 min。

1.2 功能化納米金粒子的合成

兩種不同結(jié)構(gòu)的功能化納米金粒子的制備方法如文獻(xiàn)[21]所述，簡述如下：(1)將四氯金酸和4-MBA(物質(zhì)的量之比為1∶3)共同溶解于35 mL甲醇/乙酸混合液(6∶1，V/V)中，快速攪拌條件下加入含 0．3 g NaBH4的15 mL甲醇溶液，加熱回流30 min，產(chǎn)生的黑色分散相在冷卻到室溫后繼續(xù)攪拌30 min。隨后將分散相轉(zhuǎn)移到離心管中，于8 000 r·min-1下離心沉降10 min，得到的黑色固體以乙醚沖洗3次，隨后用干燥N2氣流吹干待用。此黑色固體即為4-巰基苯甲酸功能化功能化納米金粒子 (4-MBA@GNP)；(2)分別制備PVP的甲醇溶液和四氯金酸的甲醇溶液，按照金屬鹽-吡啶單元的物質(zhì)的量之比為1∶2的比例，快速攪拌條件下將兩者共混10 min后，快速向溶液中加入NaBH4濃度為3．0 mg·mL-1的甲醇溶液，此時可以觀察到溶液顏色由棕黃色迅速變?yōu)槲⒎奂t色，表明金納米粒子已經(jīng)產(chǎn)生，此外由于溶液中發(fā)生的均相還原反應(yīng)會導(dǎo)致溶液pH值升高。在進(jìn)一步攪拌30 min后，將得到金納米溶膠液冷卻到室溫。其中獲得的納米金溶膠即為聚乙烯基吡啶包覆納米金粒子(Py-GNP)。

1.3 固酶電極的制備

使用2種納米金粒子作為固酶載體分別構(gòu)筑力學(xué)性能穩(wěn)定的固酶陰極和固酶陽極 (即較大剪切力作用于電極表面時，兩種電極表面修飾的納米金粒子都不會脫落，與電極接觸的溶液的UV-Vis譜圖中沒有觀察到文獻(xiàn)[21]中出現(xiàn)的功能化納米金粒子的特征吸收峰)，現(xiàn)分別簡述如下：

1．3．1 對巰基苯甲酸功能化納米金粒子偶聯(lián)酶基電極的制備

首先將事先預(yù)處理過的金盤電極浸泡于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0．5%的PEI水溶液中6 h便可得到-NH2功能化的金電極，隨后將此電極轉(zhuǎn)移到含PAA濃度為0．3 g·L-1的甲醇溶液中繼續(xù)浸泡30 min，便可得到-COOH修飾的電極表面，取出電極轉(zhuǎn)移至PVP的甲醇溶液中(濃度為 0．3 g·L-1)浸泡 30 min以飽和吸附一層 PVP。隨后將吸附PVP的金電極浸泡在含4-MBA@GNP濃度為 0．5 g·L-1的甲醇-乙酸(10∶1,V/V)混合溶液中 1 h,獲得對巰基苯甲酸功能化納米金粒子修飾電極 (記為4-MBA@GNP/Au)，再以EDC和NHS(物質(zhì)的量之比為5∶1)的混合液活化此電極表面的羧基。最后將活化后的4-MBA@GNP/Au浸泡在含有GOx濃度為3．0 g·L-1或含有 Lac 濃度為 6．0 g·L-1的 0．2 mol·L-1PBS 緩沖溶液中 (pH=6．0)8 h，即可得到固酶陽極 GOx/4-MBA@GNP/Au和固酶陰極Lac/4-MBA@GNP/Au。類似地，在修飾一層酶分子后，按照之前相同的方法，此電極先后浸入PVP的甲醇溶液和4-MBA@GNP的甲醇-乙酸混合液后就可以獲得未偶聯(lián)酶的新4-MBA@GNP修飾電極表面，可以繼續(xù)固定酶分子，重復(fù)這一過程，就可以得到自組裝的層疊層納米金粒子固酶電極。這種電極的構(gòu)筑過程參見圖1。

圖1 對巰基苯甲酸功能化納米金粒子固酶自組裝電極制備示意圖Fig．1 Schematic illustration for the preparation of 4-mercaptobenzoic acid functionalized nano-gold particle with immobilized enzymes self-assembly multi-layered electrode

1．3．2 吡啶官能團(tuán)功能化納米金粒子吸附酶基電極的制備

首先將事先預(yù)處理過的金盤電極浸泡于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的巰基乙胺溶液中8 h便可得到-NH2功能化的金電極表面，隨后將此電極轉(zhuǎn)移到含PAA濃度為0.3 g·L-1的甲醇溶液中繼續(xù)浸泡45 min，便可得到-COOH修飾的電極表面，取出電極轉(zhuǎn)移至含Py-GNP濃度為0.5 g·L-1的甲醇溶液中6 h，憑借Py-GNP納米粒子表面的吡啶基團(tuán)中的N原子和-COOH之間的氫鍵作用，獲得吡啶官能團(tuán)功能化納米金粒子修飾電極(記為Py-GNP/Au)，最后將此電極于4℃條件下浸泡在含有GOx濃度為3.0 g·L-1或含有Lac濃度為6.0 g·L-1的0.2 mol·L-1PBS緩沖溶液中(pH=6.0)12 h，憑借 Py-GNP納米粒子表面的吡啶基團(tuán)中的N原子與酶分子表面氨基酸殘基中的-COOH之間的氫鍵作用吸附酶分子，即可得到固酶陽極GOx/Py-GNP/Au和固酶陰極Lac/Py-GNP/Au。這種電極的構(gòu)筑過程參見圖2。

圖2 聚乙烯基吡啶包覆納米金粒子固酶電極制備示意圖Fig.2 Schematic illustration for the preparation of poly(vinylpyridine)overlappd nano-gold particle with entrapped enzymes modified electrode

1.4 固酶納米金粒子的表征

納米金粒子固酶前后的形貌以透射電鏡(TEM)進(jìn)行表征。采用紫外-可見分光光度法(UV-Vis)測定固定Lac納米復(fù)合物吸收光譜的具體方法如下：將Lac溶解于 PBS 中得到 5.0×10-2g·cm-3的溶液(游離 Lac)，倒入比色皿中進(jìn)行紫外可見吸收光譜(UV-Vis)測定。將2種納米金粒子溶液與酶充分接觸(參看1.3節(jié))，分別制備好固定Lac的2種納米金粒子復(fù)合物溶液 (濃度均為0.5 g·L-1)，移取此液200μL均勻地涂覆在ITO玻璃片上，室溫下干燥，最后插入比色槽中進(jìn)行UV-Vis測定。

1.5 固酶電極的直接電化學(xué)及電催化性能

采用循環(huán)伏安法(CV)研究固酶電極的直接電化學(xué)行為及催化底物氧化/還原性能。將以上各種固酶陽極和固酶陰極分別作為工作電極，與參比電極(Ag/AgCl電極)以及自制對電極(鉑絲)連接成一個三電極系統(tǒng)，置于一個容積為25 mL的玻璃電解池中。測試電極的直接電化學(xué)行為時，加入的電解質(zhì)為不含任何底物且事先通入N2除氧至少30 min的PBS；測試固酶陽極的電催化氧化性能前，電解池內(nèi)注入不同葡萄糖濃度的PBS緩沖液并以高純N2鼓泡除氧至少30 min，測試時電解液上方繼續(xù)通入N2以維持無氧氣氛；而測試固酶陰極的電催化還原性能前，需向PBS緩沖液鼓泡通入高純O2至少15 min以使溶液為O2飽和，測試時電解液上方繼續(xù)通入O2以維持氧氣氣氛。文中給出的電流-電壓曲線(i-E曲線)均為電極達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)時掃描所得 (即第五圈掃描時所得i-E曲線)。固酶電極擔(dān)載酶的質(zhì)量按照文獻(xiàn)[23]給出的方法(用石墨爐原子吸收分光光度法測定電極固酶前后溶液中含銅量的變化，以計(jì)算電極表面固定Lac的質(zhì)量)進(jìn)行測定。

1.6 固酶燃料電池的組裝和性能評估

圖3 組裝的納米功能金粒子固酶基燃料電池的示意圖Fig.3 Schematic illustration for the fabrication of functionalized nano-gold particle with immobilized enzymes-based fuel cell

將構(gòu)筑的固定GOx的陽極和固定Lac的陰極，放入一個玻璃制兩極室電池中。2個極室上方各有一個進(jìn)氣口，以導(dǎo)氣管與氣源連接，陽極電解液含有不同濃度的除氧葡萄糖PBS緩沖溶液(pH=6．0)；而陰極室則充入為氧氣飽和的PBS緩沖溶液(pH=6．0)，兩者均無需加入任何電子中介體。電阻值范圍在0～100 kΩ的外加負(fù)載與組裝的兩個電極相連接，籍調(diào)節(jié)負(fù)載的電阻值調(diào)控電池的輸出電壓和輸出電流密度，電池的結(jié)構(gòu)及組裝示意圖參見圖3。

本文中如無特殊說明，所涉及的電位均為相對于標(biāo)準(zhǔn)氫參比電極 (NHE)的值。酶基陽極GOx/4-MBA@GNP/Au，GOx/Py-GNP/Au以及固酶陰極Lac/4-MBA@GNP/Au,Lac/Py-GNP/Au的活性表面積按文獻(xiàn)[24]給出的方法：以鐵氰化鉀為探針，測定值分別為0．009、0．007 cm2和 0．011、0．010 cm2。測定的電流密度系輸出電流對活性面積歸一化所得。所有實(shí)驗(yàn)操作皆在室溫(25．0±0．40)℃，常壓下進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 固定Lac納米金粒子的表征

將4-MBA@GNP與4-MBA的紅外光譜FTIR進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)：前者的光譜圖中除了2 556 cm-1附近對應(yīng)于巰基SH伸縮振動吸收峰(參見支持信息圖S1)消失之外，其他吸收峰位置與后者相似，這表明4-MBA成功地覆蓋在納米金粒子表面。圖4為4-MBA@GNP固酶前(a)和后(b)的TEM照片(限于篇幅，僅以4-MBA@GNP固定Lac為例，4-MBA@GNP固定GOx，Py-GNP固定 GOx和 Lac的情況與此類似，其TEM不再給出)。從圖4可以看出，制備的4-MBA@GNP納米金粒子基本保持球形，其平均粒徑大約15 nm；而4-MBA@GNP固定Lac后由于納米金粒子表面固定酶分子官能團(tuán)(-NH2和-COOH)之間相互作用-化學(xué)偶聯(lián)以及氫鍵，導(dǎo)致納米金粒子易于形成較大的無規(guī)則團(tuán)簇，不再保持單個納米金粒子的球形粒子形狀，而且由于酶分子包覆于納米金粒子的表面，使得固酶納米金粒子團(tuán)簇 (圖4b)較單個納米金粒子(圖4a)的亮度更灰暗一些，這與文獻(xiàn)[15]報道的類似體系結(jié)果相近。

圖4 4-MBA@GNP固定Lac前(a)和后(b)的TEM照片F(xiàn)ig．4 TEM images of 4-MBA@GNPbefore(a)and after(b)laccase immobilization

圖5 為游離Lac溶液，Lac/4-MBA@GNP及 Lac/Py-GNP薄膜的UV-Vis光譜圖，從圖5可以看出：三者在～605 nm附近均出現(xiàn)一個強(qiáng)吸收峰，其對應(yīng)于Lac活性中心T1氧化態(tài)銅離子在周圍配體作用下的d-d配位躍遷[25]。這表明，2種功能化納米金粒子固定的Lac均較好地保留游離Lac活性中心固有的配位構(gòu)型和中心離子價態(tài)，但兩者的吸收峰強(qiáng)度存在顯著差異，由于4-MBA@GNP可通過化學(xué)偶聯(lián)方式固定酶分子，不但可穩(wěn)定地固定酶分子，同時也增加了納米金粒子對Lac的擔(dān)載量 (吸收峰強(qiáng)度明顯高于Lac/Py-GNP)；與此相對，Py-GNP僅是通過氫鍵作用固定Lac分子，不但穩(wěn)定性較差，而且由于吡啶官能團(tuán)在納米金粒子表面分布的隨機(jī)性，使其固定Lac量不高。石墨爐原子吸收法測定結(jié)果與上述結(jié)論相一致，Lac/4-MBA@GNP/Au和Lac/Py-GNP/Au對Lac的擔(dān)載量分別為 240．0 和 56．0 mg·g-1。 同時測試結(jié)果還表明：石英片上固酶多層薄膜在400、500 nm(4-MBA@GNP固酶電極)以及530 nm(Lac/Py-GNP/Au固酶電極)處吸光度隨固酶納米金粒子修飾層數(shù)的增加線性升高，這一結(jié)果與文獻(xiàn)[21]類似；此外605 nm處吸收峰強(qiáng)度會隨著固酶層數(shù)的增加線性升高，這表明可以通過層疊層自組裝的方式成功構(gòu)筑固酶多層電極。

圖5 游離Lac和2種功能化納米金粒子薄膜的UV-Vis光譜Fig．5 UV-Vis spectra of free Lac solution,thin films of two kinds of functionalized nano-gold particles

2.2 固酶電極的直接電化學(xué)及催化氧還原性能

2．2．1 固酶電極的直接電化學(xué)行為

圖6 固酶陽極GOx/4-MBA@GNP/Au(a)和固酶陰極Lac/4-MBA@GNP/Au(b)在無底物的除氧0．2 mol·L-1 PBS(pH=6．0)中掃描所得的CV曲線Fig．6 CV curves of bioanode GOx/4-MBA@GNP/Au(a)and biocathode Lac/4-MBA@GNP/Au(b)recorded in deaerated 0．2 mol·L-1 PBS(pH=6．0)in the absence of any substrate

圖6 為固酶陽極GOx/4-MBA@GNP/Au以及自組裝多層(5層Lac)固酶陰極Lac/4-MBA@GNP/Au分別在 0．2 mol·L-1無氧 PBS(pH=6．0)中掃描所得 CV 曲線(為了保證氧化還原峰電流之比數(shù)值接近且都接近于電子遷移可逆的狀態(tài)，測試固酶陽極和固酶陰極在無底物和中介體的PBS溶液中CV曲線時采用不同電位掃描速率)。從圖6a可以看出：，固酶前的納米金粒子修飾金盤電極在掃描電位區(qū)間范圍內(nèi)沒有任何與背景電流區(qū)分的氧化還原信號，而當(dāng)該電極固酶之后，在同一電位區(qū)間范圍內(nèi)出現(xiàn)了一對明顯的氧化還原峰，對應(yīng)于GOx活性中心核黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)以準(zhǔn)可逆方式得失電子的氧化還原峰(陰陽極峰電流之比 ip,a/ip,c=0．8，中值電位-244 mV，接近文獻(xiàn)[26]報道的FAD式電位-220 mV vs NHE)，按文獻(xiàn)[15]介紹的方法可以估算出電極表面固定的、實(shí)現(xiàn)直接電子遷移的 GOx 分子濃度為 1．3×10-8mol·cm-2；而對于圖 6b 所示的Lac/4-MBA@GNP/Au來說，則能觀察到一對峰形更對稱的氧化還原峰(ip,a/ip,c=0．86，峰電位差為67 mV，中值電位552 mV)，根據(jù)文獻(xiàn)[27]報道的Lac各活性中心的式電位數(shù)據(jù)，這對準(zhǔn)可逆的氧化還原峰可歸因于固定于電極表面的Lac活性中心T1與納米金粒子間發(fā)生單電子氧化還原反應(yīng) (中值電位E1/2=780 mV vs NHE)，電位負(fù)移230 mV應(yīng)與納米金粒子與Lac分子之間的相互作用(Au與酶分子表面氨基酸殘基的相互作用)相關(guān)。根據(jù)前述估算方法也可以類似地估算出固酶陰極表面實(shí)現(xiàn)直接電子遷移的Lac分子濃度為1．24×10-8mol·cm-2， 大致與陽極表面實(shí)現(xiàn)直接電子遷移的GOx分子濃度相同，但僅有文獻(xiàn)[28]報道的NAFION薄膜吸附Lac修飾熱解石墨電極上導(dǎo)電酶分子濃度 6．6×10-8mol·cm-2的五分之一左右(需要說明的是，隨著實(shí)現(xiàn)直接電子遷移的自組裝固酶層數(shù)的增加，相同掃速下氧化還原峰面積及由此計(jì)算所得的導(dǎo)電酶分子濃度也隨之線性升高，與2．1節(jié)結(jié)論一致，即表明電極表面實(shí)現(xiàn)直接電子遷移的酶分子以層疊層方式，成功構(gòu)筑固酶多層電極)。

與 4-MBA@GNP/Au固酶電極不同，Py-GNP/Au固酶電極在不引入外加電子中介體時無法實(shí)現(xiàn)酶活性中心與導(dǎo)電基體-納米金粒子間的直接電子遷移(限于篇幅，本文僅以Lac/Py-GNP/Au為例，參見圖7和支持信息圖S2，GOx/Py-GNP/Au與此類似，圖不再給出)，與文獻(xiàn)報道的固酶電極類似，當(dāng)加入電子中介體ABTS時才可有效實(shí)現(xiàn)酶-電極間電子遷移 (圖7)，出現(xiàn)一對ABTS氧化還原態(tài)相互轉(zhuǎn)化的準(zhǔn)可逆氧化還原峰，中值電位～720 mV，此反應(yīng)受擴(kuò)散控制[29]。分析Lac/4-MBA@GNP/Au在不含任何中介體的無氧PBS中以不同掃速獲得的CV曲線(參見支持信息圖S3)可知，無論是陽極峰電流還是陰極峰電流，在較低電位掃速范圍(2～200 mV·S-1)內(nèi)，峰電流與掃速保持良好的線性關(guān)系，而且峰電位基本保持穩(wěn)定，ip,a/ip,c一直接近于1，這表明發(fā)生在此電極上的電化學(xué)反應(yīng)是一個表面控制型的準(zhǔn)可逆單電子氧化還原反應(yīng)[15]。

圖 7 固酶電極 Lac/Py-GNP/Au在含 ABTS1．0 mmol·L-1的無氧PBS(pH=4．4)中掃描所得的CV曲線Fig．7 CV curve of electrode with entrapped enzyme:Lac/Py-GNP/Au recorded in deaerated PBS(pH=4．4)in the presence of mediator at concentration level:1．0 mmol·L-1

2．2．2 固酶電極的催化氧還原性能

圖8為2種不同結(jié)構(gòu)的固酶陰極Lac/Py-GNP/Au(a)和Lac/4-MBA@GNP/Au(b)分別在含中介體ABTS濃度為1．0 mmol·L-1的PBS和不含任何中介體的 PBS中掃描獲得的CV曲線。從圖8a可以看出，Lac/Py-GNP/Au分別在無氧，空氣飽和以及氧氣飽和的PBS(pH=4．4)中掃描獲得的CV曲線有明顯區(qū)別：當(dāng)溶液中含有氧氣時，還原峰電流有明顯的增加而氧化峰電流則明顯的降低。此現(xiàn)象表明Lac在中介體存在時對氧還原有明顯的電催化作用(參見支持信息圖S2，當(dāng)固酶電極在無中介體存在時對氧還原僅有極微弱的催化性能)，可歸因于氧氣存在促進(jìn)了酶催化氧化產(chǎn)生的ABTS陰離子自由基的氧化，從圖8a還可以看出，這一電極對底物氧的濃度較為敏感，隨著PBS中氧分壓的增加，產(chǎn)生的催化氧還原電流也明顯上升，但電極在氧氣飽和及空氣飽和的PBS中產(chǎn)生的催化電流之比(7．1)遠(yuǎn)高于 2 種溶液中氧氣濃度之比(～4．6)。這表明催化循環(huán)的決速步并非是氧氣擴(kuò)散過程，而是ABTS氧化態(tài)在溶液中的擴(kuò)散，這表明此催化反應(yīng)主要受制于中介體的擴(kuò)散過程。從圖8b則可以看出，電極在氧氣飽和溶液中所得CV中陰極還原電流在0．96 V開始急劇增加，并在0．8 V附近達(dá)到極限，同時陽極氧化峰消失，而且隨著電極表面固定酶量的增加(表現(xiàn)為固酶層數(shù)的增多)，催化還原電流隨之上升，這些結(jié)果表明通過這種方式固定的Lac不但實(shí)現(xiàn)了酶活性中心T1與導(dǎo)電基體間的直接電子遷移，而且隨著電極表面固酶量的增加，催化性能也得以進(jìn)一步提升直至達(dá)到導(dǎo)電酶分子的飽和濃度，此時催化電流達(dá)到極限值(固酶自組裝層數(shù)為5)，此后繼續(xù)增加電極表面固酶層數(shù)則催化電流將緩慢下降(限于篇幅，圖不再給出)。這可以歸因于過多的酶增大了電極表面的電阻，而且排列緊密的酶分子很可能由于分子間的相互作用聚集成簇(參見圖4b)，降低了酶分子與底物接觸面積，導(dǎo)致酶催化活性下降。根據(jù)0．6 V時所得的極限催化電流ilim,cat=23．8μA，前面計(jì)算所得的導(dǎo)電Lac分子表面濃度Γ以及電極活性表面積A等數(shù)據(jù)，由文獻(xiàn)[30]給出的公式可估算出實(shí)現(xiàn)酶-電極間直接電子遷移的Lac基電極上單位時間內(nèi)氧分子轉(zhuǎn)化平均速率為0．5 s-1，這一數(shù)值較文獻(xiàn)[31,13,15]報道的類似電極的催化氧還原速率(0．14、0．09 和 0．06 s-1)有較大的提升(不同電位掃描速率下獲得的還原電流密度雖然不一樣，但是按照本文實(shí)驗(yàn)部分給出定義求算的極限催化電流密度以及不同掃速下求算的導(dǎo)電酶分子濃度卻是相同的)，表明以具有大π共軛體系修飾的納米器件作為固酶載體的電極的確具有相對高的催化性能，但載體結(jié)構(gòu)與催化效能的關(guān)系還需要進(jìn)一步定量研究。

2．2．3 固酶陰極催化氧還原性能的重現(xiàn)性和長期穩(wěn)定性

圖8 CV法表征Lac/Py-GNP/Au(a)和Lac/4-MBA@GNP/Au(b)的催化氧還原性能Fig．8 Catalytic effect on oxygen reduction reaction(ORR)of Lac/Py-GNP/Au(a)and Lac/4-MBA@GNP/Au(b)characterized by CV

對于燃料電池而言，固酶電極的催化性能的重現(xiàn)性和長期穩(wěn)定性是影響電池性能的重要指標(biāo)和未來實(shí)現(xiàn)實(shí)用化的重要前提。支持信息圖S4分別給出了5個不同時間按照同樣方法制備的2種不同結(jié)構(gòu)的固酶陰極(限于篇幅，固酶陽極測試結(jié)果與此類似，不再給出)在氧氣飽和的PBS溶液中測得極限催化電流密度的對比圖以及在同樣溶液中所測得的極限催化電流密度與電極低溫儲存時間的依賴關(guān)系曲線，對于Lac/Py-GNP/Au而言，測試條件同圖8a，而對于Lac/4-MBA@GNP/Au，測試條件參見圖8b(自組裝固酶層數(shù)為5)。從圖S4可以看出，5個不同的Lac/4-MBA@GNP/Au所測得的極限催化電流密度沒有明顯差異，而相同數(shù)量的Lac/Py-GNP/Au之間的差異較前者更為顯著，這表明Lac/4-MBA@GNP/Au催化性能重現(xiàn)性較Lac/Py-GNP/Au更佳。此外還可看出Lac/4-MBA@GNP/Au催化性能的穩(wěn)定性也遠(yuǎn)優(yōu)于Lac/Py-GNP/Au：前者在儲存21 d后的極限催化電流密度仍然可以保持最初值的80%以上，而后者僅使用3 d后催化性能就降低到最初值的2/3左右，使用10 d后基本失去催化活性，以上結(jié)果均表明Lac/4-MBA@GNP/Au催化氧還原的重現(xiàn)性和長期使用性均遠(yuǎn)優(yōu)于Lac/Py-GNP/Au，這除了后者固定Lac的穩(wěn)定性不如前者之外，與中介體ABTS的長期使用穩(wěn)定性能欠佳也有很大關(guān)聯(lián)。

2．2．4 固酶陰極催化氧還原性能的熱穩(wěn)定性和酸堿耐受性

支持信息圖S5給出了固酶陰極Lac/4-MBA@GNP/Au在氧氣飽和的PBS溶液中 (測試條件參見圖8b，自組裝固酶層數(shù)為5)，測得極限催化電流密度與溫度的依賴關(guān)系曲線和極限催化電流密度-溶液pH值關(guān)系曲線，從圖S5可看出：電極Lac/4-MBA@GNP/Au催化氧還原性能與游離Lac類似，存在一個最佳pH值(6．0)(游離Lac的最佳pH值為3．0附近，這種差異與載體-酶分子間的相互作用有關(guān)聯(lián)[32-33])；還可觀察到在測試溫度范圍內(nèi)，隨著溫度升高，在328 K之前極限催化電流密度隨溫度升高而單調(diào)遞增，而當(dāng)溫度超過328 K之后催化性能急劇下降，這個結(jié)果與文獻(xiàn)[34]報道固酶電極的催化電流密度-溫度關(guān)系非常相似。根據(jù)圖中數(shù)據(jù)可以估算出電池催化反應(yīng)的表觀活化能大約是38．2 kJ·mol-1，而酶變性的活化能則大約是58．8 kJ·mol-1。以上結(jié)果表明此電極很可能以化學(xué)吸附的形式固定Lac，而當(dāng)溫度升高后酶變性從而造成電池輸出性能下降，但較大的變性活化能也表明此電極對溫度具有較強(qiáng)的耐受力。需要指出的是，另一種固酶陰極Lac/Py-GNP/Au催化氧還原的酸堿耐受性類似于文獻(xiàn)[35]報道的固酶電極，均受限于固定酶固有的活性-pH值依賴關(guān)系和固酶載體對酸堿的耐受性，其熱穩(wěn)定性遠(yuǎn)遜于Lac/4-MBA@GNP/Au，催化活性隨溫度升高逐漸下降，當(dāng)溫度升至313 K時，催化活性就下降到了不到初始值的1/3，這可以歸因于溫度升高使載體表面物理吸附的酶分子脫附 (溫度升高前后溶液中銅離子濃度有明顯變化且溶液中加入ABTS會變成淺綠色，證明酶分子從電極表面脫落進(jìn)入溶液)。

2.3 組裝固酶燃料電池的性能

支持信息圖S6為固酶陽極GOx/4-MBA@GNP/Au在含不同濃度葡萄糖的0．2 mol·L-1無氧PBS中以相同掃速掃描所得CV曲線，從圖S6可以看出，當(dāng)PBS中加入葡萄糖后，在-0．03 V附近氧化電流開始明顯增加，在0．2 V左右達(dá)到極限同時陰極峰電流迅速降低，隨著加入葡萄糖濃度的增加，極限催化氧化電流也隨之上升，直至葡萄糖濃度足夠高(＞60 mmol·L-1)，達(dá)到飽和催化電流為止(31μA左右)，由此按照2．2．2節(jié)相似方法，根據(jù)前述給出的導(dǎo)電GOx分子表面濃度和電極活性表面積，可以估算出固酶催化底物葡萄糖氧化的速率為1．3 s-1，相對于固定Lac催化氧分子轉(zhuǎn)化速率0．5 s-1而言處于一個數(shù)量級但卻是后者數(shù)值的2．6倍，有鑒于此,當(dāng)將2個固酶電極組裝為燃料電池時，不需要在兩極室之間以常用的NAFION離子交換膜分隔開，因此降低了輸出能量損失。需要指出的是GOx/Py-GNP/Au既不能實(shí)現(xiàn)酶與納米金粒子之間的直接電子遷移，也觀察不到催化葡萄糖氧化的電信號，只能如文獻(xiàn)[26]報道的體系那樣，在引入外加電子中介體的情況下才可以實(shí)現(xiàn)有效催化葡萄糖氧化，測試結(jié)果類似文獻(xiàn)[26]。

圖9 固酶陽極GOx/4-MBA@GNP/Au和固酶陰極Lac/4-MBA@GNP/Au分別在陽極和陰極電解液中以100 mV·s-1掃描所得的極化曲線Fig．9 Polarization curves of bioanode GOx/4-MBA@GNP/Au and biocathode Lac/4-MBA@GNP/Au recorded in anolyte and catholyte at scan rate:100 mV·s-1

圖9 為固酶陽極GOx/4-MBA@GNP/Au在含葡萄糖(1 mmol·L-1)的氧氣飽和 PBS(pH=6．0)中，固酶陰極Lac/4-MBA@GNP/Au 在氧氣飽和 PBS(pH=6．0)中，以相同掃速獲得的極化曲線(固酶自組裝層數(shù)都是5)，從圖9可看出固酶陽極氧化電位始于-0．03 V，陰極還原起始電位在0.96 V附近，當(dāng)反應(yīng)為底物擴(kuò)散控制時，催化電流達(dá)到極限。值得注意的是，當(dāng)陰陽極底物濃度相近時，陽極極限催化電流是陰極極限催化電流的近2倍，這表明陰陽極反應(yīng)均受底物擴(kuò)散控制而且此電池的能量輸出受限于陰極氧還原過程，這與前述討論得到結(jié)論相一致。陰極還原過程成為決速步的原因可能源于固酶載體表面的固酶納米金粒子團(tuán)簇過于龐大，不利于氧氣傳質(zhì)，加上酶與氧分子有效接觸不充分，降低了酶的有效催化活性，當(dāng)固酶層數(shù)增加之后，此現(xiàn)象會更為顯著(與2.2.2節(jié)結(jié)論相一致)。

由GOx/4-MBA@GNP/Au和Lac/4-MBA@GNP/Au組成4-MBA@GNP固酶基生物燃料電池 (無NAFION隔膜，電解液為含葡萄糖 1.0 mmol·L-1的 O2飽和PBS，pH=6.0)，其極化和性能曲線見圖10。由GOx/Py-GNP/Au和Lac/Py-GNP/Au組成Py-GNP/Au固酶基生物燃料電池 (陰陽極室以厚度0.125 mm為NAFION隔膜Nafion 115分隔，陽極電解液為含葡萄糖1.0 mmol·L-1+0.5 mmol·L-1二茂鐵甲酸 (FMCA) 的無氧PBS，pH=6.0，陰極電解液為O2飽和的含ABTS 1.0 mmol·L-1PBS，pH=6.0)， 其極化和性能曲線見支持信息圖S7。從圖 10和支持信息圖 S7可以看出，4-MBA@GNP固酶基生物燃料電池的開路電壓(OCV)約為0.88 V，在0.24 V具有最大輸出能量密度，大約是864.0μW·cm-2。由于固酶陰極上酶-電極間電子遷移速率不夠快以及氧分子與固定酶反應(yīng)不充分等原因，OCV與理論最大輸出電壓0.99 V還存在110 mV的電壓差，但相對于其他文獻(xiàn)[2,24]報道的類似納米體系固酶電池的OCV和最大輸出能量密度要高出很多，即使是與貴金屬中心離子作為活性位點(diǎn)的氧化還原聚合物電子中介體的固酶體系[3,22]相比，能量輸出性能也處在同一數(shù)量級而且還無需使用昂貴的貴金屬試劑和復(fù)雜的合成路線，具有成本低且制備簡單的優(yōu)勢。相比較而言，Py-GNP/Au固酶基生物燃料電池的OCV(0.46 V)和最大輸出能量密度(77.0μW·cm-2)都比前者低很多，因?yàn)槭褂秒娮又薪轶w和隔膜降低了電池的最大輸出電壓，中介體擴(kuò)散速率較慢加之酶與電子中介體化學(xué)反應(yīng)速率受電極表面固酶聚集形態(tài)影響，輸出能量密度不高，更重要的是，隨著電極使用時間的延長，由于酶，電子中介體的變性或電子傳遞性能的下降，使用電子中介體的酶燃料電池的長期使用性能一般比直接電子遷移型酶燃料電池差(圖11)：前者儲存3 d后輸出功率就下降到最大值的2/3左右，這與前述結(jié)論相一致；相對而言，能夠?qū)崿F(xiàn)酶-電極間直接電子遷移的自組裝多層酶燃料電池不但具有更高的能量輸出功率，而且具有優(yōu)異的長期使用性能，儲存3周后輸出功率仍可達(dá)到最佳能量輸出的80%以上，這與該電極上固酶載體對酶具有良好的親和力以及適當(dāng)?shù)拿?載體間相互作用有很大關(guān)聯(lián)。

圖10 4-MBA@GNP固酶基葡萄糖/O2燃料電池的極化和能量輸出性能曲線Fig.10 Polarization curve and energy out-put performance curve of 4-MBA@GNPwith immobilized enzymebased glucose/O2 fuel cell

圖11 兩種功能化納米金粒子固酶基葡萄糖/O2燃料電池能量輸出的長期穩(wěn)定性Fig.11 Long-term stability in energy out-put performance of two kinds of functionalized nano-gold particles with immobilized enzyme-based glucose/O2 fuel cell

3 結(jié) 論

本文采用2種功能化納米金粒子：Py-GNP和4-MBA@GNP作為固酶載體和導(dǎo)電基體，以化學(xué)偶聯(lián)或物理吸附的方式固定Lac和GOx分子，同時利用聚合物/酶-納米金粒子相互之間的氫鍵作用構(gòu)筑自組裝多層固酶電極，以電化學(xué)方法研究這些電極的直接電子遷移性能和催化底物反應(yīng)性能，在此基礎(chǔ)上評估了由這些電極組裝的酶基燃料電池的能量輸出性能，得到如下結(jié)論： (1)4-MBA@GNP作為固酶載體構(gòu)筑的固酶陽極和固酶陰極都可以實(shí)現(xiàn)酶活性中心與導(dǎo)電基體之間的直接電子遷移，而且對相應(yīng)底物-葡萄糖和氧氣具有優(yōu)異的催化性能，同時具有較快的電子遷移速率。(2)可實(shí)現(xiàn)直接電子遷移的4-MBA@GNP基固酶電極不但具有良好的重現(xiàn)性和長期使用性，而且酸堿耐受性和熱穩(wěn)定性都優(yōu)于Py-GNP/Au基固酶電極，前者還可通過自組裝方式獲得多層固酶電極，以獲得更高的催化性能，但當(dāng)固酶層數(shù)過多時，催化性能會逐漸降低。(3)4-MBA@GNP基固酶電極組裝得到的酶燃料電池相對于Py-GNP/Au基固酶電極組裝成的酶燃料電池而言具有以下優(yōu)勢：無需引入電子中介體和隔膜，具有更高的OCV和更大的能量輸出密度，以及更優(yōu)良的長期使用性能。但這種電池由于底物擴(kuò)散受限和酶-底物接觸反應(yīng)不充分等原因，電池輸出性能還有提升的空間。

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