利用低溫聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)提高大豆超氧化物歧化酶活性

張麗媛，馬紅丹，趙邯鄲，徐丹丹，曲　靜，關(guān)淑艷，*，王丕武，*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林長春130118）

利用低溫聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)提高大豆超氧化物歧化酶活性

張麗媛1，馬紅丹1，趙邯鄲1，徐丹丹1，曲靜2，關(guān)淑艷1，*，王丕武2，*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林長春130118）

目的：利用低溫聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對大豆超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的活性進(jìn)行改良。方法：將6種在較低退火溫度下擴(kuò)增出的超氧化物歧化酶基因插入到表達(dá)載體pREP5N上，構(gòu)建pPM1、pPM2、pPM3、pPM4、pPM5、pPM6表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到工程菌，誘導(dǎo)其在大腸桿菌中進(jìn)行蛋白表達(dá)，并進(jìn)行酶活力測定，篩選高酶活力菌株。結(jié)果：將已克隆的目的基因序列與已知的大豆MnSOD基因序列比對分析，一致性平均為86.57%，氨基酸序列同源性平均為82.58%。對已獲得的6種工程菌進(jìn)行蛋白質(zhì)提取，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果顯示表達(dá)產(chǎn)物的分子質(zhì)量約為26kD。經(jīng)1%差異水平分析，改良后的SOD酶活力均有極顯著提高，平均比對照菌株的酶活力提高1.95倍。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)證明低溫聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是改變酶活性的一種有效方法，為超氧化物歧化酶在生產(chǎn)中的應(yīng)用提供了技術(shù)支持。

超氧化物歧化酶基因；低溫聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；酶活力

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是一種源于生命體的活性物質(zhì)，是一種特定的具有生物催化功能的蛋白質(zhì)，是生物體內(nèi)各個(gè)組織中唯一能夠特異性清除、平衡氧自由基的抗氧化酶，消除生物體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)［1-3］。SOD在機(jī)體衰老過程中扮演著重要角色，現(xiàn)已被制成藥丸或藥片劑型的營養(yǎng)補(bǔ)充品［4-5］。在食品工業(yè)中，SOD可作為食品抗氧化劑，防止過氧化酶引起的食品變質(zhì)及腐爛現(xiàn)象，或作為食品營養(yǎng)的強(qiáng)化劑，有延緩衰老的作用；在化工行業(yè)中，SOD可作為化妝品的添加劑，有抗皺、祛斑、防曬及抗炎等功效；按照結(jié)合的金屬離子不同，可將SOD分為3種類型：FeSOD、Cu/ZnSOD、MnSOD。其中，MnSOD主要存在于細(xì)胞線粒體中［6-9］，而線粒體是自由基產(chǎn)生的場所，因此MnSOD在線粒體中有非常重要的地位，此外，MnSOD無論在用藥途徑還是臨床應(yīng)用范圍都是相當(dāng)廣泛的，已逐漸被公認(rèn)為是一種新型腫瘤抑制因子和抗炎癥藥物，很可能在不久的將來用于惡性腫瘤的治療［6，10-11］。對MnSOD的研究已經(jīng)受到生物化學(xué)界、醫(yī)（藥）學(xué)界、化工界的高度重視，因此積極開展MnSOD基因工程及其下游技術(shù)的研究有重大意義［8，12-13］。

天然酶在自然條件下已經(jīng)進(jìn)化了千百萬年，但是酶分子仍然蘊(yùn)藏著巨大的進(jìn)化潛力，這是酶體外定向進(jìn)化的基本先決條件［14］。低溫聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)是酶分子改造的一種新策略，該方法通過降低退火溫度對待改造基因進(jìn)行定向進(jìn)化研究，以期獲得酶活力提高及其他酶學(xué)性質(zhì)有所改善的突變酶，此方法不需要事先了解酶的空間結(jié)構(gòu)、活性位點(diǎn)和催化機(jī)制等因素，在待改造酶基因的PCR擴(kuò)增反應(yīng)中隨機(jī)引入突變，構(gòu)建突變庫，憑借定向選擇的方法選出所需性質(zhì)優(yōu)化的酶，可在較短時(shí)間內(nèi)完成。迄今為止，利用PCR進(jìn)行定點(diǎn)突變的方法主要包括：重組PCR法、重疊延伸法、含U模板法和大引物突變法等，然而這些方法操作較為復(fù)雜，步驟較為繁瑣［15］。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)GenBank已發(fā)表的大豆MnSOD基因DNA序列，利用同源性設(shè)計(jì)引物［16］，采用低溫PCR技術(shù)使已得到的超氧化物歧化酶基因發(fā)生隨機(jī)突變，進(jìn)行酶活性改造，提高超氧化物歧化酶活性，篩選高酶活性菌株，為超氧化物歧化酶在生產(chǎn)中的應(yīng)用提供技術(shù)支持。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株、質(zhì)粒

大腸桿菌菌株DH5α（E. coli DH5α）、質(zhì)粒pREP5NMnSOD、pMD18-T Vector、穿梭表達(dá)載體pREP5N，均由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)植物生物技術(shù)中心實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2試劑

PCR相關(guān)試劑、T4連接酶、各種限制性內(nèi)切酶、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）日本TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）北京鼎國生物工程有限公司；其他試劑和藥品均為國產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank已發(fā)表的大豆MnSOD基因的DNA序列（序列號(hào)AJ440726），應(yīng)用Premier5.0引物設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)特異性引物，為了便于載體構(gòu)建，在上游引物和下游引物的5'端分別引入限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)。上游引物：5'-ATT GTC GAC ATG GCC GCG CGA GCT CTG T-3'（劃線部分為SalⅠ的酶切位點(diǎn)），下游引物：5'-GCG GAT CCC TAA GAG CTC TCT TTC TCA TAC-3'

（劃線部分為BamHⅠ的酶切位點(diǎn)）。引物由三博遠(yuǎn)志有限公司合成。

1.2.2超氧化物歧化酶基因的低溫PCR擴(kuò)增

以質(zhì)粒pREP5N-MnSOD為模板，設(shè)置6種退火溫度對超氧化物歧化酶基因進(jìn)行擴(kuò)增［17］，分別為22.0、25.6、28.7、36.2、39.5、42.9℃，各自進(jìn)行以下反應(yīng)，反應(yīng)體系為：5μL10×PCR Buffer（5mmol/L Mg2+Plus）；0.5μL dNTP（10mmol/L）；上下引物各0.5μL；1μL質(zhì)粒DNA；0.3μL Taq酶（5U/μL），超純水補(bǔ)至總體積為25μL。PCR程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性40s，按上述6種退火溫度退火1min，72℃延伸70s，共30個(gè)循環(huán)，72℃后延伸10min，4℃保存［18-19］。PCR產(chǎn)物電泳后，分別回收擴(kuò)增片段并分別與pMD18-T Vector連接，轉(zhuǎn)化E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布固體LB（含100mg/mL氨芐青霉素（ampicillin，Amp））平板，抗性篩選陽性轉(zhuǎn)化子，送至三博遠(yuǎn)志有限公司進(jìn)行測序。

1.2.3低溫PCR擴(kuò)增產(chǎn)物表達(dá)載體的構(gòu)建

挑取轉(zhuǎn)化子搖菌、提取質(zhì)粒后，進(jìn)行常規(guī)退火溫度（52℃）的PCR，將純化后的PCR產(chǎn)物和穿梭表達(dá)載體pREP5N經(jīng)BamHⅠ和SalⅠ雙酶切4h后回收，回收產(chǎn)物按1∶4（V/V）比例混合后加入T4DNA連接酶連接過夜，將連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)E. coli DH5α，在含氨芐青霉素（Amp+100mg/mL）的LB培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選［20］，利用質(zhì)粒提取試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒DNA的提取，分別將重組表達(dá)載體命名為pPM1、pPM2、pPM3、pPM4、pPM5、pPM6，進(jìn)行PCR、雙酶切鑒定。

1.2.4目的基因氨基酸序列分析

利用DNAMAN軟件將目的基因測序結(jié)果與GenBank（AJ440726）已發(fā)表的大豆MnSOD基因序列進(jìn)行比對，同時(shí)與原序列基因進(jìn)行氨基酸序列比對分析。

1.2.5目的基因在大腸桿菌中的表達(dá)及酶活性測定

將重組表達(dá)載體pPM1、pPM2、pPM3、pPM4、pPM5、pPM6通過大腸桿菌轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到工程菌，命名為E. coli DH5α（pPM1）～E. coli DH5α（pPM6），利用終濃度為1mmol/L的IPTG對工程菌誘導(dǎo)培養(yǎng)，進(jìn)行超聲波破碎，條件為：功率1100W，超聲波5s、間歇5s，總超聲波時(shí)間15min。提取酶液，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）分析［21］。參照氮藍(lán)四唑法（nitro-blue tetrazolium，NBT）進(jìn)行酶活性測定，并對酶活性進(jìn)行1%差異水平分析。

2　結(jié)果與分析

2.1超氧化物歧化酶低溫PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖1　質(zhì)粒低溫PCR產(chǎn)物PCRFig.1Low temperature PCR products from plasmid

如圖1所示，在800bp左右有擴(kuò)增條帶，測序結(jié)果顯示，DNA片段大小分別為814、814、823、821、795、826bp。

2.2低溫PCR擴(kuò)增產(chǎn)物表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

圖2重組表達(dá)載體PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.2Agarose gel electrophoresis of PCR products

圖3重組表達(dá)載體的酶切鑒定結(jié)果Fig.3Enzyme digestion identification of expression vectors pPM1，pPM2，pPM3，pPM4，pPM5and pPM6

對已構(gòu)建的pPM1、pPM2、pPM3、pPM4、pPM5、pPM6重組表達(dá)載體進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定，如圖2、3所示，經(jīng)PCR及SalⅠ+BamHⅠ雙酶切均得到大小約為814、814、823、821、795、826bp左右的特異帶，結(jié)果表明經(jīng)低溫?cái)U(kuò)增的片段已成功連接到穿梭表達(dá)載體pREP5N上，保存菌種用于下一部分表達(dá)實(shí)驗(yàn)。

2.3目的基因氨基酸序列比對結(jié)果

將已克隆的6個(gè)目的基因序列與已發(fā)表的大豆MnSOD基因序列進(jìn)行氨基酸序列比對，比對結(jié)果（圖4）表明氨基酸序列同源性分別為86.19%、86.52%、84.87%、87.73%、88.59%、64.55%。

圖4目的基因氨基酸序列與原氨基酸序列比對結(jié)果Fig.4Alignment of target amino acid sequence and original gene sequence

2.4目的蛋白結(jié)構(gòu)分析

經(jīng)ProMod Version3.70的分析，6種酶蛋白均有MnSOD的特征性催化位點(diǎn)，表明該蛋白屬于MnSOD型超氧化物歧化酶蛋白的類似物，同時(shí)構(gòu)建目的基因表達(dá)產(chǎn)物的3D立體結(jié)構(gòu)圖（圖5），其立體結(jié)構(gòu)中含有典型的MnSOD特征性催化位點(diǎn)的折疊結(jié)構(gòu)，當(dāng)退火溫度分別為22.0、25.6、28.7、36.2、39.5、42.9℃時(shí)，6種酶蛋白的理論等電點(diǎn)及原酶等電點(diǎn)分別為7.37、6.64、8.50、8.45、8.30、8.27、8.56。其中在206～213、206～213、210～217、218～225、217～226、208～215、202～209處共含有1個(gè)MnSOD特征性催化位點(diǎn)。如圖5所示，突變酶蛋白與原超氧化物歧化酶三維蛋白結(jié)構(gòu)整體相似。

圖5目的基因表達(dá)產(chǎn)物的3D立體結(jié)構(gòu)預(yù)測圖Fig.5Predicted three-dimensional stru ctures of the expression products of target genes

根據(jù)突變后的比對結(jié)果，結(jié)合文獻(xiàn)［22］中MnSOD的空間位點(diǎn)，其第62、117、200、204位以及第82、83、160位的氨基酸對于活性中心與底物的結(jié)合有一定作用，結(jié)合本研究所獲得的突變氨基酸序列與原序列對比的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)MnSOD活性中心組氨酸（His）周圍存在酪氨酸（Tyr）突變?yōu)楸奖彼幔≒he）的突變位點(diǎn)，由于此位點(diǎn)靠近酶的活性區(qū)域，因此對酶活性有很大影響，酪氨酸（Tyr）為極性氨基酸，苯丙氨酸（Phe）為非極性氨基酸，此突變降低了此區(qū)域的極性，因此更加突顯出了超氧化物歧化酶活性中心組氨酸（His）與天冬氨酸（Asp）等關(guān)鍵氨基酸的極性，進(jìn)而提高了底物分子對于Mn2+的識(shí)別能力，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)在其識(shí)別底物分子的敏感區(qū)域第82位的蛋氨酸（Met）突變?yōu)樘K氨酸（Thr），雖然此突變導(dǎo)致環(huán)境極性有所提高，但由于此位點(diǎn)與超氧陰離子自由基進(jìn)入活性區(qū)域有直接關(guān)系且蘇氨酸（Thr）對于蛋氨酸（Met）而言空間位阻較小，因此也有提高自由基結(jié)合活性中心的可能性，進(jìn)而提高超氧化物歧化酶的活性。

圖6蛋白質(zhì)在大腸桿菌中表達(dá)的SDS-PAGE分析AGEFig.6SDS-PAGE analysis of expressed proteins in E. coli DH5α

2.5目的基因在大腸桿菌中的表達(dá)如圖6所示，目的蛋白的分子質(zhì)量約為26.0kD，蛋白質(zhì)表達(dá)量基本相同。另外在含空載體大腸桿菌的細(xì)胞裂解物中，不存在分子質(zhì)量大小約為26.0kD的條帶。

2.6表達(dá)產(chǎn)物的酶活力

表1　SOD酶活力分析Table1Superoxide dismutase activities of different strains

如表1所示，由突變菌株E. coli DH5α（pPM1）～E. coli DH5α（pPM6）與原菌株酶活力的比值可知其酶活力均有極顯著提高（P＜0.01），平均提高1.95倍。

3　結(jié)論與討論

關(guān)于SOD酶活力的測定方法，目前已建立了很多種，但由于SOD的底物極不穩(wěn)定，至今尚未找到一種既簡便又準(zhǔn)確的檢測SOD酶活性的方法，一般測定SOD酶活性的方法均屬間接法，主要有化學(xué)測定法、免疫測定法、等電凝膠法［23］，但各方法間測定結(jié)果的差異很大，不具有可比性，本研究利用NBT光化還原法對超氧化物歧化酶活性進(jìn)行檢測，該方法在測定比較純的樣品時(shí)重復(fù)性較好、無需貴重儀器和試劑、方法簡便、靈敏度高、結(jié)果穩(wěn)定，適用于一般實(shí)驗(yàn)室采用。

本研究通過低溫PCR擴(kuò)增大豆超氧化物歧化酶MnSOD基因，并成功構(gòu)建穿梭表達(dá)載體（pPM1～pPM6），將目的基因序列與已知大豆MnSOD基因序列進(jìn)行比對分析，結(jié)果表明基因一致性平均為86.57%，氨基酸序列同源性平均為82.58%。誘導(dǎo)其在大腸桿菌中表達(dá)，通過SDS-PAGE檢測，得到了與預(yù)期大小相符的目的蛋白條帶，經(jīng)分析6種蛋白均有MnSOD特征性催化位點(diǎn)，屬于MnSOD型酶蛋白，證明了目的基因表達(dá)產(chǎn)物的催化功能。根據(jù)測定超氧化物歧化酶常用的方法NBT光還原法分別測定E. coli DH5α（pPM1）～E. coli DH5α（pPM6）菌株已表達(dá)的蛋白酶活力，結(jié)果表明目的蛋白酶酶活力平均比對照菌株的酶活力提高1.95倍。本研究表明利用低溫PCR技術(shù)改變酶活性是一種有效的方法，上述結(jié)果為超氧化物歧化酶在生產(chǎn)中的應(yīng)用提供技術(shù)支持，對利用大腸桿菌工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)SOD具有一定的指導(dǎo)借鑒作用。

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Improved Superoxide Dismutase Activity in Soybean by Low Temperature Polymerase Chain Reaction（PCR）

ZHANG Liyuan1，MA Hongdan1，ZHAO Handan1，XU Dandan1，QU Jing2，GUAN Shuyan1，*，WANG Piwu2，*
（1.College of Life Sciences，Jilin Agricultural University，Changchun130118，China；2.Faculty of Agronomy，Jilin Agricultural University，Changchun130118，China）

Objective：This study aims at modifying the activity of superoxide dismutase in soybean by low temperature PCR.Methods：Six amplified superoxide dismutase genes at low annealing temperatures were inserted into the expression vector pREP5N to construct the new vectors pPM1，pPM2，pPM3，pPM4，pPM5and pPM6.These expression vectors were introduced into E. coli for enzyme expression.The enzyme activity was determined for screening strains with high enzyme activity.Results：The alignment analysis of cloned sequences versus published MnSOD sequences showed that the consistency was86.57%on average.The homology of amino acid sequences was82.58%.The molecular weights of the proteins extracted from six strains were approximately26kD as determined by SDS-PAGE.Enzyme activity was significantly improved（P <0.01）by1.95folds on average.Conclusion：The findings of this study provide technical support for the application of superoxide dismutase.

superoxide dismutase gene；low temperature polymerase chain reaction；enzyme activity

Q786

A

1002-6630（2015）05-0126-05

10.7506/spkx1002-6630-201505024

2014-04-16

農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目（2013GB2B100125）；吉林省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（20120215）；吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)啟動(dòng)基金項(xiàng)目（201242）

張麗媛（1987—），女，碩士，研究方向?yàn)橹匾r(nóng)藝性狀基因的分離功能鑒定及品種改良。E-mail：790844929@qq.com

關(guān)淑艷（1971—），女，教授，博士，研究方向?yàn)橹匾r(nóng)藝性狀基因的分離功能鑒定及品種改良。

E-mail：458194095@qq.com

王丕武（1958—），男，教授，博士，研究方向?yàn)橹匾r(nóng)藝性狀基因的分離功能鑒定及品種改良。

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