包紅朵，張鵬禹，，周　艷，張莉莉，張　輝，陶明煊，王　冉，*

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品質(zhì)量安全與檢測(cè)研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全控制技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地-江蘇省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210014；2.南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院，江蘇南京210097）

沙門氏菌裂解性噬菌體的分離鑒定及其生物學(xué)特性

包紅朵1，張鵬禹1，2，周艷1，張莉莉1，張輝1，陶明煊2，王冉1，*

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品質(zhì)量安全與檢測(cè)研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全控制技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地-江蘇省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210014；2.南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院，江蘇南京210097）

從家禽屠宰場(chǎng)污水中，以腸炎沙門氏菌ATCC13076和禽沙門氏菌CVCC2184為宿主菌，分離到兩株裂解性沙門氏菌噬菌體，分別命名為vB_SenM-PA13076（簡稱PA13076）和vB_SenM-PC2184（簡稱PC2184）。同時(shí)對(duì)這兩株噬菌體進(jìn)行了噬菌斑、噬菌譜系（含耐藥菌）、形態(tài)學(xué)（透射電鏡）、遺傳物質(zhì)、酸堿及熱穩(wěn)定性、最佳感染復(fù)數(shù)、一步生長曲線等生物學(xué)特性研究。結(jié)果表明：兩株噬菌體的裂解空斑均透亮清晰；除對(duì)本身宿主菌產(chǎn)生強(qiáng)裂解作用，還裂解其他沙門氏菌，為寬噬菌譜，其中PA13076能強(qiáng)裂解一株耐氨芐青霉素ATCC13076轉(zhuǎn)化菌株（A+13076），PC2184則能裂解另一株耐氨芐青霉素CVCC2184轉(zhuǎn)化菌株（A+2184）；電鏡觀察這兩株噬菌體均為肌尾病毒科；遺傳物質(zhì)為dsDNA；pH值和溫度耐受能力較好；PA13076、PC2184最佳感染復(fù)數(shù)分別為0.01、10，潛伏期分別為20、30min，爆發(fā)期分別為70、60min，平均爆發(fā)量分別為21、23。

腸炎沙門氏菌；裂解性噬菌體；生物學(xué)特性；耐藥性

沙門氏菌（Salmonella）居食源性疾病致病菌之首位，是全球最常見食源性病原菌，常引起食品安全事故［1］。DuPont等［2］報(bào)道沙門氏菌引起的食源性疾病在持續(xù)增加，表明當(dāng)前食源性致病菌的滅菌技術(shù)并非絕對(duì)可靠。中國疾病控制中心報(bào)告的食物中毒數(shù)據(jù)顯示沙門氏菌引起的發(fā)病人數(shù)比例居首，達(dá)13.8%［3］。2013年10月9日，美國18個(gè)州爆發(fā)了沙門氏菌引起的食物中毒事件，近300人生病［4］；4d后美國南舊金山4萬磅禽類產(chǎn)品又因沙門氏菌污染召回［5］。可見，沙門氏菌污染可帶來嚴(yán)重的食品安全隱患，更嚴(yán)峻的是，沙門氏菌的耐藥性正日益增強(qiáng)［6］，在中國［7-8］和其他國家［9］都正在引起廣泛關(guān)注。

噬菌體作為細(xì)菌的天敵，已被科學(xué)家作為對(duì)付多重耐藥菌新的希望，因此也成為了當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。2006年，美國食品藥品管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)李斯特菌噬菌體制劑在即食食品（ready-to-eat）和禽類產(chǎn)品中使用，隨后，沙門氏菌噬菌體產(chǎn)品如Intralytix公司的SalmonFresh也相繼通過美國FDA評(píng)價(jià)食品添加劑的安全性指標(biāo)認(rèn)證（Generally Recognized as Safe，GRAS），獲得FDA應(yīng)用批準(zhǔn)，這為噬菌體的商業(yè)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。本研究分離獲得兩株裂解性腸炎沙門氏菌噬菌體，并分析了其生物學(xué)特性和裂解特性，為噬菌體產(chǎn)品控制沙門氏菌污染或感染的進(jìn)一步研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)參考。

1　材料與方法

1.1菌種、培養(yǎng)基與試劑

菌種：分離噬菌體的宿主菌為腸炎沙門氏菌ATCC13076、禽沙門氏菌CVCC2184；腸炎沙門氏菌分離株K14、K16、K17、K23、K27、SR1、SR2、SR3、SR4、SR5；鼠傷寒沙門氏菌ATCC13311，分離株J521、K12；甲型副傷寒沙門氏菌ATCC50073，乙型副傷寒沙門氏菌分離株HNER067-1、HNER067-2、J300、J342；雞白痢沙門氏菌CMCC533，分離株S96115、C905、S96116、S9627、S8645、S9685、S96109、S9695、S9103、S0701、S9649、S11-2、S11-3、S11-4-1、S11-4-2；鴨沙門氏菌分離株D9；2株耐氨芐青霉素腸炎沙門氏菌A+13076、A+2184（由本實(shí)驗(yàn)室通過導(dǎo)入質(zhì)粒pUC18分別標(biāo)記ATCC13076和CVCC2184制得）。污水樣：采自南京及周邊家禽屠宰場(chǎng)。

TSB-YE、LB培養(yǎng)基、瓊脂青島高科園海博生物科技有限公司；聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）8000、DNaseⅠ、RNaseA酶北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；限制性內(nèi)切酶日本TaKaRa公司；氯仿、鹽酸、NaCl、MgSO4·7H2O均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

5810R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)德國Eppendorf公司；SW-CJ-1F超凈臺(tái)蘇州真田潔凈設(shè)備有限公司；HZL-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱太倉市強(qiáng)樂實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；DHP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱上海一恒科技有限公司；DELTA320pH計(jì)瑞士Mettler Toledo公司；HFU486Basic超低溫冰箱德國Thermo公司。

1.3方法

1.3.1噬菌體的分離富集

參照Mclaughlin等［10］的方法分別以腸炎沙門氏菌ATCC13076和禽沙門氏菌CVCC2184為宿主菌分離噬菌體，首先在南京及周邊家禽屠宰場(chǎng)采集污水樣品，水樣中加無菌生理鹽水對(duì)濃稠水樣稀釋，濾紙過濾，4℃條件下8000×g離心濾液20min，得上清液，用0.22μm微孔濾膜過濾除菌。取濾液5mL，分別加入ATCC13076、CVCC2184等沙門氏菌液1mL和15mL LB培養(yǎng)液，室溫靜置30min，37℃、150r/min振蕩過夜進(jìn)行噬菌體富集培養(yǎng)。4℃、8000×g離心過夜培養(yǎng)物20min，取上清重復(fù)富集操作3次，用0.22μm濾膜過濾得含噬菌體的原液，4℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2噬菌斑的純化及噬菌體顆粒制備

進(jìn)行單層平板點(diǎn)樣實(shí)驗(yàn)［11］，用涂布棒將100μL過夜培養(yǎng)的宿主菌于LB平板上涂開，滴加噬菌體原液10μL，陰性對(duì)照組（CK）滴加等量LB培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)12h，觀察菌苔形成情況。挑選菌苔上出現(xiàn)明顯溶菌空斑的樣品，進(jìn)行雙層平板實(shí)驗(yàn)［12］。噬菌體原液用SM緩沖液進(jìn)行10倍稀釋，取100μL合適濃度梯度的稀釋液與100μL對(duì)應(yīng)宿主菌混勻靜置15min，加入3.5mL55℃左右的0.6%瓊脂LB培養(yǎng)基，迅速混勻倒入1.2%瓊脂LB平板上，凝固后37℃培養(yǎng)12h。標(biāo)記雙層平板上形態(tài)一致的典型噬菌斑，用槍頭移取噬菌斑于5mL LB培養(yǎng)液中，加入200μL對(duì)應(yīng)宿主菌，室溫放置15min，37℃條件下培養(yǎng)12h，4℃、11000×g離心10min，得上清液。單一噬菌斑重復(fù)該純化操作3～5次即得純化噬菌體。

噬菌體純化顆粒通過《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中關(guān)于λ噬菌體顆粒的PEG/NaCl沉淀提取方法進(jìn)行制備［13］，噬菌體顆粒溶于SM緩沖液中，4℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3噬菌體宿主譜的點(diǎn)樣實(shí)驗(yàn)

采用點(diǎn)樣實(shí)驗(yàn)分析噬菌體的噬菌譜［14］。統(tǒng)計(jì)各細(xì)菌的裂解情況即得該噬菌體的宿主譜。

1.3.4噬菌體透射電鏡觀察

將10μL噬菌體（108～1010PFU/mL）滴加在銅網(wǎng)上，靜置沉淀15min，吸去多余液體。滴加體積分?jǐn)?shù)2%、pH7.0的磷鎢酸（phosphotungstic acid，PTA）染色5～10min［12］，自然干燥后用日立H7650型透射電子顯微鏡觀察噬菌體形態(tài)。

1.3.5噬菌體遺傳物質(zhì)酶切分析

參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》提取噬菌體基因組［13］，并于-20℃條件下保存?zhèn)溆?。限制性核酸?nèi)切酶有HindⅢ、EcoRⅠ、EcoRⅤ、PstⅠ、SalⅠ、BamHⅠ、SacⅠ、NcoⅠ，根據(jù)酶供應(yīng)商的說明書進(jìn)行基因組酶切操作，酶作用結(jié)束后，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳，成像觀察。

1.3.6噬菌體酸堿穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性的測(cè)定

調(diào)pH值分別為2、3、4、5、6、8、9、10、11、12、13的蛋白胨水。取不同pH值蛋白胨水與噬菌體等量混合，37℃水浴2h測(cè)定效價(jià)；取100μL噬菌體于離心管中，測(cè)定初始效價(jià)，將離心管分別于30、40、50、60、70、80℃的水浴環(huán)境中作用30、60min，測(cè)定噬菌體效價(jià)變化。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，每次設(shè)2個(gè)平行。

1.3.7噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）的測(cè)定

取對(duì)數(shù)期宿主菌，按不同感染復(fù)數(shù)1∶1000、1∶100、1∶10、1∶1、10∶1、100∶1加入噬菌體和宿主菌，37℃、150r/min振蕩培養(yǎng)5h，10000×g、4℃離心10min，得上清液測(cè)定各組噬菌體效價(jià)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，設(shè)置不加噬菌體的宿主菌培養(yǎng)液為實(shí)驗(yàn)對(duì)照。

1.3.8噬菌體一步生長曲線實(shí)驗(yàn)分析

參考Leuschner等［15］的方法，取對(duì)數(shù)期細(xì)菌，以MOI≥10加入噬菌體，37℃水浴15min，10000×g離心1min，去上清，LB液洗滌兩次，細(xì)菌沉淀加入37℃條件預(yù)熱的LB液中混勻，迅速于37℃、180r/min振蕩培養(yǎng)，同時(shí)開始計(jì)時(shí)。每10min取樣測(cè)噬菌體效價(jià)，設(shè)立不加噬菌體的宿主培養(yǎng)液和不加宿主菌的噬菌體作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照。以感染時(shí)間為橫坐標(biāo)，噬菌體效價(jià)對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制一步生長曲線，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次設(shè)2個(gè)平行。

2　結(jié)果與分析

2.1噬菌體的分離純化及其噬菌斑形態(tài)、透射電鏡觀察

圖1　腸炎沙門氏菌噬菌體原液單層平板點(diǎn)樣實(shí)驗(yàn)Fig.1Spot tests of Salmonella enteritidis bacteriophages in the liquid samples

由圖1可知，在單層平板上點(diǎn)樣得到腸炎沙門氏菌ATCC13076和禽沙門氏菌CVCC2184的噬菌空斑，而陰性對(duì)照組（CK）正常長出菌苔。在雙層平板上兩株噬菌體均呈現(xiàn)出典型裂解性噬菌體特征，空斑透亮，邊緣整齊清晰，無暈環(huán)。37℃培養(yǎng)12h，在LB培養(yǎng)平板上PA13076噬菌斑直徑為0.5～1.0mm，PC2184為1.0～1.5mm（圖2）。

圖2腸炎沙門氏菌噬菌體PA13076（A）和禽沙門氏菌噬菌體PC21842184（B）的噬菌斑Fig.2Plaques of Salmonella enteritidis phage PA13076（A）and Salmonella phage PC2184（B）

圖3噬菌體PA13076（A）和PC2184（B）的透射電鏡觀察Fig.3Ttransmission electron micrographs of phage PA13076（A）and PC2184（B）

由圖3可知，噬菌體PA13076頭部偏橢圓形，長徑約87nm，橫徑約66nm，具有可收縮性尾，尾長約90nm，直徑約18nm，頭部與尾部被頸圈隔開，PC2184頭部呈正多面體形狀，長徑約68nm，橫徑約65nm，具有可收縮肌鞘，尾長約106nm，直徑約17nm，按國際病毒分類委員會(huì)分類規(guī)則［15］，將它們歸為有尾噬菌體目，肌尾病毒科。

2.2噬菌體的宿主譜分析

噬菌體PA13076能裂解ATCC13076、A+13076等17株不同種的沙門氏菌；而PC2184能裂解CVCC2184、A+2184等33株沙門氏菌；這些宿主菌中涵括耐藥性腸炎、腸炎、鼠傷寒、雞白痢、乙型副傷寒和鴨沙門氏菌；同時(shí)它們也具有一定范圍的交叉宿主菌譜（表1）。

表1　噬菌體PC2184和PA130766的宿主譜Table1Host range of phage PC2184and PA1133007766

續(xù)表1

2.3噬菌體遺傳物質(zhì)的酶切鑒定分析

圖4噬菌體PA13076和PC2184基因組DNAA酶切圖譜Fig.4Agarose gel electrophoresis of the genomes of phage PA13076and PC2184digested with restriction enzymes

將提取得到的噬菌體基因組進(jìn)一步進(jìn)行酶切電泳實(shí)驗(yàn)，由圖4可知，合適的限制性核酸內(nèi)切酶處理噬菌體基因組后，DNA被消化片段化，表明它們的遺傳物質(zhì)為dsDNA（雙鏈DNA）。

噬菌體PA13076基因組能被限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和EcoRⅤ切開，PC2184則能被EcoRⅠ、EcoRⅤ和HindⅢ切開，其他限制性內(nèi)切酶不能消化它們的基因組（圖4）。酶切片段經(jīng)計(jì)算得到噬菌體PA13076的基因組大小約為57k b，而PC2184為59kb，更準(zhǔn)確的基因組大小要在測(cè)序后才能確定，根據(jù)酶切片段只能進(jìn)行大概估算。

2.4噬菌體的酸堿穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性

圖5噬菌體PA13076（A）和PC2184（B）對(duì)酸堿的耐受能力Fig.5Resistance of PA13076（A）and PC2184（B）to acid and alkali

由圖5可知，噬菌體PA13076在pH6～11范圍內(nèi)效價(jià)較穩(wěn)定，pH值小于6以及大于11都會(huì)引起效價(jià)的明顯減少，但在pH值為12的強(qiáng)堿環(huán)境中噬菌體仍具有較高效價(jià)，pH≤3或≥13時(shí)，才基本檢測(cè)不到噬菌斑。PC2184在pH6～9范圍內(nèi)效價(jià)較穩(wěn)定，pH值降到5或升到10時(shí)，效價(jià)下降較明顯，當(dāng)pH≤4或≥12，大部分噬菌體已經(jīng)失活。

圖6噬菌體PA13076（A）和PC2184（B）對(duì)溫度的耐受能力Fig.6Resistance of PA13076（A）and PC2184（B）to temperature

由圖6可知，噬菌體PA13076在各溫度下作用30、60min后效價(jià)變化無太大差別，30、40、50℃下幾乎維持在初始效價(jià)，但60℃時(shí)下降較快，70℃之后已基本無噬菌體存在；PC2184在30、40、50、60℃條件下效價(jià)下降很少，70℃時(shí)，效價(jià)降低較快，且60min組降低幅度大于30min組，80℃時(shí)，60min組已檢測(cè)不到噬菌體，30min組效價(jià)則下降到2.15×102PFU/mL，表明高溫會(huì)嚴(yán)重破壞噬菌體的活性。

2.5噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)

表2噬菌體PA13076的最佳MOII測(cè)定結(jié)果

Table2Determination of optimal multiplicity of infection（MOI）of phage PA1133007766

MOI細(xì)菌數(shù)/CFU噬菌斑/PFU效價(jià)/（PFU/mL）100∶13×1063×1085.2×10810∶13×1063×1073.3×1081∶13×1063×1061.4×1081∶103×1063×1052.1×1081∶1003×1063×1041.5×1091∶10003×1063×1032.5×108

由表2可知，噬菌體PA13076的MOI為1∶100時(shí)，宿主菌釋放的子代噬菌體效價(jià)為1.5×109PFU/mL，在各實(shí)驗(yàn)組中最高，為最佳MOI。由表3可知，當(dāng)MOI為10∶1時(shí)，PC2184的效價(jià)為7.0×109PFU/mL，是產(chǎn)生子代噬菌體顆粒最多的一組，為噬菌體擴(kuò)增時(shí)的最佳MOI值。

表3噬菌體PC2184的最佳MOI測(cè)定結(jié)果ITable3Determination of optimal multiplicity of infection（MOI）of Table3Determination of optimal multiplicity of infection（MOI）of phage PC2184C2184

2.6噬菌體的一步生長曲線

圖7噬菌體PA13076（A）和PC2184（B）在37℃的LB培養(yǎng)液中的一步生長曲線Fig.7One-step growth curves of phage PA13076（A）and PC2184（B）in LB at37℃

由圖7可知，噬菌體PA13076感染宿主菌的潛伏期約20min，爆發(fā)持續(xù)時(shí)間約70min，算得平均爆發(fā)量為21（平均爆發(fā)量=爆發(fā)末期的噬菌體效價(jià)/感染初期的宿主菌濃度）；PC2184潛伏期約30min，爆發(fā)持續(xù)時(shí)間約60min，平均爆發(fā)量為23，具有較高的裂解活性。

3　討論

3.1抗耐藥性沙門氏菌噬菌體的分離鑒定

單層平板點(diǎn)樣得到菌苔上的溶菌區(qū)域較大，可見富集后的噬菌體效價(jià)較高。通過點(diǎn)樣驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)有些實(shí)驗(yàn)菌中出現(xiàn)較混濁的溶菌區(qū)域或外圈透亮但中間混濁的環(huán)狀溶菌區(qū)域，表明該實(shí)驗(yàn)菌對(duì)該噬菌體不完全敏感。雙層平板實(shí)驗(yàn)在噬菌體研究中既是噬菌體數(shù)量（效價(jià)）計(jì)算的基本方法，也是噬菌體篩選純化的經(jīng)典手段［16］。根據(jù)包紅朵［12］和王冉［17］等的報(bào)道，雙層平板上裂解性噬菌體的噬菌斑規(guī)則透亮、邊緣清晰，與本研究中噬菌斑的特點(diǎn)吻合。綜合形態(tài)學(xué)等信息，將這兩株噬菌體命名為vB_SenM-PC2184和vB_SenM-PA13076，其中vB：viruses bacteriophage（病毒噬菌體）；Sen：Salmonella enteritidis（腸炎沙門氏菌）；M：Myoviridae（肌尾病毒科）。該命名比一般文獻(xiàn)中報(bào)道的更科學(xué)，能表達(dá)出噬菌體必要的一些分類信息。Bueno等［18］對(duì)兩株噬菌體進(jìn)行類似命名為vB_SauS-phi-IPLA35和vB_SauS-phi-IPLA88，其中Sau：Staphylococcus aureus（金黃色葡萄球菌）；S：Siphoviridae（長尾病毒科）。噬菌體按核酸類型及單雙鏈形式分為4個(gè)“群”，“群”是噬菌體分類的第一個(gè)級(jí)階［15］，dsDNA病毒群在文獻(xiàn)中最為常見，種類最多，本研究兩株噬菌體也不例外。

本研究兩株噬菌體均能裂解多株分離菌，屬寬譜噬菌體，噬菌體PC2184宿主譜較噬菌體PA13076廣，能裂解實(shí)驗(yàn)室39株沙門氏菌中的33株（84.6%），宿主譜可為兩株噬菌體的復(fù)配殺菌應(yīng)用提供參考。Carey-Smith等［19］曾報(bào)道噬菌體FGCSSa1，其宿主譜涵括6株不同種沙門氏菌；Capparelli等［20］分離到腸炎沙門氏菌噬菌體Ф1，則能裂解18株沙門氏菌中的16株。值得注意的是，PA13076能強(qiáng)裂解一株耐氨芐青霉素腸炎沙門氏菌A+13076；而PC2184對(duì)另一株耐氨芐青霉素腸炎沙門氏菌A+2184的溶菌空斑不夠清晰，裂解作用稍弱。這兩株噬菌體所呈現(xiàn)出的對(duì)耐藥性腸炎沙門氏菌的裂解性，為耐藥性腸炎沙門氏菌的殺滅及其生物防控提供了新的解決思路，并為相關(guān)新型抗菌劑的研究提供了有力佐證。

3.2兩株噬菌體的生物學(xué)特性研究

PC2184的酸堿耐受能力不及PA13076，但明顯優(yōu)于JS01等噬菌體［21］，PA13076耐酸堿能力很強(qiáng)，尤其對(duì)堿的耐受能力明顯優(yōu)于PK88-4、LipG2-5等噬菌體［17，22］，與qds001類似，在一定程度上畏酸嗜堿［23］。PC2184熱穩(wěn)定性較高，與PK88-4等噬菌體相近［17］；PA13076熱穩(wěn)定性不及PC2184，與LipG2-5相仿［21］，但明顯優(yōu)于qds001等噬菌體［23］。本研究中噬菌體耐酸堿能力和耐熱性的數(shù)據(jù)可為其實(shí)際應(yīng)用條件提供參考。

根據(jù)Lu等［11］描述，感染發(fā)生前噬菌體與宿主菌數(shù)量的比值即為感染復(fù)數(shù)，獲得子代噬菌體產(chǎn)量最高的即為最佳感染復(fù)數(shù)。感染復(fù)數(shù)是研究噬菌體投入與產(chǎn)出量效關(guān)系的重要指標(biāo)［20］，最佳MOI因噬菌體種類不同而存在差異，在噬菌體產(chǎn)品的生產(chǎn)制備中將具有重要的指導(dǎo)意義。噬菌體生長可分為3個(gè)時(shí)期：噬菌體在宿主菌上的吸附；噬菌體在宿主菌里面的生長（潛伏期）；噬菌體的釋放（爆發(fā)期）［24］。潛伏期是指從噬菌體吸附宿主菌到第一次爆發(fā)開始之間的時(shí)間區(qū)段，爆發(fā)量即為最終釋放出來的噬菌體顆粒數(shù)與潛伏期初始感染的宿主菌細(xì)胞數(shù)的比值［11］。于龍等［25］報(bào)道的噬菌體SM701的潛伏期約30min，與PC2184相近，爆發(fā)期約100min，爆發(fā)量約63，均大于本研究的兩株噬菌體。Leuschner等［15］報(bào)道的噬菌體PWH2與本研究相比顯示出更長的潛伏期，達(dá)到90min，爆發(fā)期60min，爆發(fā)量較高，為110。本研究得到兩株全新的腸炎沙門氏菌噬菌體PA13076和PC2184，與其他噬菌體相比具有一些共性的生物學(xué)特性，但又表現(xiàn)出不一樣的特點(diǎn)，特別是它們對(duì)耐藥宿主菌的裂解作用，為后續(xù)針對(duì)耐藥性腸炎沙門氏菌的防控研究提供了重要的參考意義。

[1] 倪佳琳，許浩，胡雪明，等.2006—2012年上海市基于網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室的腸炎沙門菌耐藥監(jiān)測(cè)［J］.疾病監(jiān)測(cè)，2013，28（5）：369-375.

[2] DUPONT H L.The growing threat of foodborne bacterial enteropathogens of animal origin［J］.Clinical Infectious Diseases，2007，45（10）：1353-1361.

[3] 焦新安，涂長春，黃金林，等.我國食源性人獸共患細(xì)菌病流行現(xiàn)狀及其防控對(duì)策［J］.中國家禽，2009，31（19）：4-11.

[4] 匯通網(wǎng).美國政府關(guān)門的罪過：18個(gè)州爆發(fā)“沙門氏菌”事件［EB/OL］.（2013-10-09）［2015-01-22］.http：//forex.hexun.com/2013-10-09/158565806.html.

[5] 中國新聞網(wǎng).美國多款雞類產(chǎn)品或染沙門氏菌緊急召回4萬磅雞［EB/OL］.（2013-10-14）［2015-01-22］.http：//www.chinanews.com/ gj/2013/10-14/5376784.shtml.

[6] HUR J，JAWALE C，LEE J H.Antimicrobial resistance of Salmonella isolated from food animals：a review［J］.Food Research International，2012，45（2）：819-830.

[7] LI Ruichao，LAI Jing，WANG Yang，et al.Prevalence and characterization of Salmonella species isolated from pig s，ducks and chickens in Sichuan Province，China［J］.International Journal of Food Microbiology，2013，163（1）：14-18.

[8] YAN He，LI Lin，ALAM M J，et al.Prevalence and antimicrobial resistance of Salmonella in retail foods in northern China［J］.International Journal of Food Microbiology，2010，143（3）：230-234.

[9] G?MEZ-LAGUNA J，HERN?NDEZ M，CREUS E，et al.Prevalence and antimicrobial susceptibility of Salmonella infections in free-range pigs［J］.The Veterinary Journal，2011，190（1）：176-178.

[10] MCLAUGHLIN M R，BALAA M F，SIMS J，et al.Isolation of Salmonella bacteriophages from swine effluent lagoons［J］.Journal of Environmental Quality，2006，35：522-528.

[11] LU Z，JR F B，F(xiàn)LEMINGA H P，et al.Isolation and characterization of a Lactobacillus plantarum bacteriophage，ФJL-1，from a cucumber fermentation［J］.International Journal of Food Microbiology，2003，84（2）：225-235.

[12] 包紅朵，張輝，王冉.寬噬菌體譜腸炎沙門氏菌噬菌體的生物學(xué)特性［J］.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，27（5）：1171-1121.

[13] SAMBROOK J，RUSSELL D W.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南［M］.3版.北京：科學(xué)出版社，2002：185-187；195-197.

[14] 張輝，王冉，包紅朵.裂解性福氏志賀氏菌噬菌體SF-A2的生物學(xué)特性及其在巴氏殺菌牛奶中的滅菌效果［J］.食品科學(xué)，2010，31（23）：214-218.

[15] LEUSCHNER R G K，ARENDT E K，HAMMES W P.Characterization of a virulent Lactobacillus sake phage PWH2［J］.Appllied Microbiology Biotechnology，1993，39（4/5）：617-621.

[16] 馮書章，劉軍，孫洋.細(xì)菌的病毒：噬菌體最新分類與命名［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2007，27（4）：604-608.

[17] 王冉，韓晗，張輝，等.大腸桿菌K88噬菌體的分離鑒定及其生物學(xué)特性［J］.華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2012，27（4）：163-167.

[18] BUENO E，GARC?A P，MART?NEZ B，et al.Phage inactivation of Staphylococcus aureus in fresh and hard-type cheeses［J］.International Journal of Food Microbiology，2012，158（1）：23-27.

[19] CAREY-SMITH G V，BILLINGTON C，CORNELIUS A J，et al.Isolation and characterization of bacteriophages infecting Salmonella spp.［J］.Federation of European Microbiological Societies Microbiology Letters，2006，258（2）：182-186.

[20] CAPPARELLI R，NOOCERINO N，IANNACCONE M，et al.Bacteriophage therapy of Salmonella enterica：a fresh appraisal of bacteriophage therapy［J］.The Journal of Infectious Diseases，2010，201（1）：52-61.

[21] 賈靜靜.金黃色葡萄球菌噬菌體分離及其裂解性能的研究［D］.無錫：江南大學(xué)，2012：24-25.

[22] 張輝，王冉，包紅朵.李斯特菌噬菌體的分離鑒定及其裂解特性［J］.食品科學(xué)，2012，33（7）：228-232.

[23] 蔡天舒，王靜雪，林洪，等.金黃色葡萄球菌噬菌體的生物學(xué)特性及其在牛奶中的抑菌應(yīng)用［J］.食品科學(xué)，2013，34（11）：147-151.

[24] ELLIS E L，DELBRUCK M.The growth of bacteriophage［J］.The Journal of General Physiology，1939，22（3）：365-384.

[25] 于龍，溫占波，楊文慧，等.一株黏質(zhì)沙雷氏菌烈性噬菌體污水分離及特性［J］.微生物學(xué)報(bào)，2008，48（4）：498-502.

Isolation and Biological Characteristics of Lytic Salmonella Bacteriophage

BAO Hongduo1，ZHANG Pengyu1，2，ZHOU Yan1，ZHANG Lili1，ZHANG Hui1，TAO Mingxuan2，WANG Ran1，*
（1.Jiangsu Key Laboratory of Food Quality and Safety-State Key Laboratory Cultivation Base of MOST，Key Laboratory of Control Technology and Standard for Agro-product Safety and Quality，Ministry of Agriculture，Institute of Food Safety and Inspection，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Nanjing210014，China；2.Ginling College，Nanjing Normal University，Na njing210097，Chi na）

Two lytic Salmonella bacteriophages，namely vB_SenM-PA13076（PA13076）and vB_SenM-PC2184（PC2184）that can inactivate ATCC13076or CVCC2184were isolated from the sewage samples of poultry slaughtering plants.Their biological properties were identified by plaque，host range（antibiotic-resistant bacteria），transmission electron microscopy（TEM），genetic material，pH and thermostability，optimal multiplicity of infection（MOI）and one-step growth experiment.Thei r plaq ues on host strains were clear and bright，and also caused bacteriolysis to other strains of Salmonella.PA13076could strongly cause bacteriolysis to an ampicillin-resistant strain SE A+13076，while PC2184only lyse another strain A+2184slightly.The newly isolated bacte riophages were the members of family Myoviridae according to their ultrastructure under TEM.Their genomes were dsDNA and revealed excellent tolerance to pH and temperature.The MOI of PA13076（PC2184）was0.01（10），and the latent period was20min（30min），the burst period was70min（60min）and the average burst size was21（23）phages per cell.

Salmonella enteritidis；lytic phage；biological characteristic；multi-antibiotic resistance

Q939.48

A

1002-6630（2015）05-0131-06

10.7506/spkx1002-6630-201505025

2014-04-30

江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（BK2012788）；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金探索性項(xiàng)目（CX（12）5040）；國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31402234）

包紅朵（1984—），女，助理研究員，博士研究生，主要從事噬菌體防治細(xì)菌性疾病研究。E-mail：baohongduo@jaas.ac.cn

王冉（1973—），女，研究員，博士，主要從事畜產(chǎn)品安全和健康養(yǎng)殖研究。E-mail：wangran2001@126.com