王琪，王蓓蓓，馬美湖，蔡朝霞*

（國(guó)家蛋品加工技術(shù)研發(fā)分中心，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北武漢430070）

熒光納米材料應(yīng)用于蛋白質(zhì)分析的研究進(jìn)展

王琪，王蓓蓓，馬美湖，蔡朝霞*

（國(guó)家蛋品加工技術(shù)研發(fā)分中心，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北武漢430070）

蛋白質(zhì)與人體新陳代謝、免疫應(yīng)答和疾病發(fā)生等密切相關(guān)，因此對(duì)蛋白質(zhì)研究是當(dāng)今世界共同關(guān)注的熱點(diǎn)，目前已經(jīng)滲透到生物、醫(yī)學(xué)、食品等各個(gè)領(lǐng)域。納米技術(shù)的發(fā)展極大地促進(jìn)了蛋白質(zhì)技術(shù)的研究，發(fā)展光學(xué)特性優(yōu)良、生物相容性好的功能化熒光納米材料對(duì)深入研究蛋白質(zhì)的標(biāo)記、分析以及分離具有非常重要的意義。本文主要介紹了半導(dǎo)體量子點(diǎn)、嵌入式核殼熒光納米顆粒、碳點(diǎn)、碳納米管、貴金屬元素納米簇和磁性熒光納米顆粒等熒光納米材料的基本性質(zhì)，以及各種熒光納米材料在蛋白質(zhì)標(biāo)記成像、蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)固定與分離以及蛋白質(zhì)分析檢測(cè)方面的應(yīng)用。

熒光；納米材料；蛋白質(zhì)；應(yīng)用

蛋白質(zhì)是構(gòu)成生命體的基礎(chǔ)物質(zhì)，在生物體內(nèi)起著重要作用，參與幾乎所有的生命活動(dòng)，如催化生命體內(nèi)各種反應(yīng)進(jìn)行、調(diào)節(jié)代謝、抵御外來(lái)物質(zhì)入侵及控制遺傳信息等［1］。蛋白質(zhì)與人體的新陳代謝、免疫應(yīng)答反應(yīng)和疾病的發(fā)生等都有密切的關(guān)系。因此，蛋白質(zhì)研究在食品檢驗(yàn)、臨床檢驗(yàn)和疾病診斷等方面都具有重要意義。

目前，多種方法已被用于蛋白質(zhì)研究方面。隨著納米科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，納米材料也越來(lái)越多被用在蛋白質(zhì)的研究領(lǐng)域。熒光納米材料由于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，具有一些不同于常規(guī)材料和單個(gè)分子的特殊性質(zhì)，尤其是特殊的熒光性質(zhì)，使其在光學(xué)、生物和醫(yī)藥等諸多方面有重要的應(yīng)用價(jià)值［2］。本文重點(diǎn)對(duì)多種熒光納米材料在蛋白質(zhì)研究方面的進(jìn)展進(jìn)行綜述，總結(jié)了目前用于蛋白質(zhì)研究的主要納米材料的特點(diǎn)及其在蛋白質(zhì)標(biāo)記成像、相互作用、固定與分離以及痕量分析檢測(cè)方面的基本應(yīng)用。

1　用于蛋白質(zhì)研究的常見(jiàn)熒光納米材料

1.1熒光納米材料的基本性質(zhì)

納米材料，是指在三維空間中至少有一維處于納米尺度范圍（＜100nm）或由該尺度范圍的物質(zhì)作為基本單元構(gòu)成的材料。納米材料的特殊結(jié)構(gòu)，使其具有不同于常規(guī)材料和單個(gè)分子的一些特性，主要包括比表面積大、高化學(xué)活性、特殊的光、電、磁性質(zhì)等［3］。而熒光納米材料，由于其特殊的結(jié)構(gòu)與光學(xué)特性，為化學(xué)、物理、醫(yī)學(xué)和生物領(lǐng)域的發(fā)展帶來(lái)了新的機(jī)遇。

傳統(tǒng)的熒光材料激發(fā)光譜較窄，熒光特征譜較寬且分布不對(duì)稱，光解產(chǎn)物可能對(duì)生物體產(chǎn)生殺傷作用。并且由于其本身性質(zhì)，存在光穩(wěn)定性差，容易被光漂白等缺陷。另外，作為熒光探針，傳統(tǒng)熒光材料存在分析靈敏度低、親水性差等缺陷［4］，限制了其在生物、醫(yī)學(xué)等許多方面的應(yīng)用。而熒光納米材料不僅具有較高的熒光強(qiáng)度和優(yōu)越的光穩(wěn)定性，而且可以通過(guò)控制合成條件，使一些結(jié)構(gòu)特殊的熒光納米材料具有尺寸依賴的光學(xué)特征，有利于蛋白質(zhì)的同步分析［5］；當(dāng)納米材料的發(fā)光達(dá)到近紅外光譜范圍時(shí)，應(yīng)用于生物樣品分析時(shí)，檢測(cè)背景干擾?。?］；另外，利用具有特殊磁性的納米材料，可以實(shí)現(xiàn)復(fù)雜背景的分離工作等。

1.2用于蛋白質(zhì)研究的熒光納米材料

1.2.1半導(dǎo)體量子點(diǎn)

量子點(diǎn)是主要由Ⅱ～Ⅵ族及Ⅲ～Ⅴ族元素構(gòu)成的半導(dǎo)體納米顆粒。量子點(diǎn)在研究蛋白質(zhì)方面具有許多優(yōu)勢(shì)。首先，可以用同一激發(fā)波長(zhǎng)的光源同時(shí)激發(fā)多種不同熒光的量子點(diǎn)，并且由于其發(fā)射譜帶窄而對(duì)稱，多種顏色的發(fā)射峰不易出現(xiàn)重疊與紅移拖尾，熒光光譜易于區(qū)分和識(shí)別［7］。另外，量子點(diǎn)的斯托克斯位移較大，可以有效避免激發(fā)峰與發(fā)射峰的重疊，減少干擾。此外，量子點(diǎn)的光學(xué)特征可以通過(guò)控制反應(yīng)條件有效控制［8］。圖1即顯示了同一激發(fā)波長(zhǎng)下的多色CdSe量子點(diǎn)。量子點(diǎn)熒光可調(diào)的光學(xué)特征為蛋白質(zhì)多色標(biāo)記及同步檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。近年來(lái)，金屬摻雜型量子點(diǎn)成為了人們廣泛研究的新課題。在量子點(diǎn)中摻雜微量金屬元素可以改變或者增加其發(fā)射中心的數(shù)量。其中，錳摻雜型量子點(diǎn)被研究最多，因?yàn)殄i具有獨(dú)特的磁性能和光學(xué)性能從而能夠提供很好的摻雜系統(tǒng)［9］。金屬摻雜型量子點(diǎn)基本上保留了量子點(diǎn)的所有優(yōu)點(diǎn)，另外，還可以避免由于斯托克斯位移引起的熒光自猝滅問(wèn)題，熒光壽命更長(zhǎng)［10］。

圖1　ZnS包被的CdSe量子點(diǎn)在近紫外燈下的10種不同顏色的發(fā)射光［11］11Fig.1Ten distinguishable emission colors of ZnS-capped CdSe QDs excited with a near-UV lamp［11］

1.2.2嵌入式核殼熒光納米顆粒

嵌入式核殼熒光納米顆粒是指一些負(fù)載有機(jī)熒光染料分子的無(wú)機(jī)納米顆?；蚨嗑凵锎蠓肿影恍图{米顆粒［12］。這種材料在蛋白質(zhì)標(biāo)記成像中有固有優(yōu)點(diǎn)。首先，納米顆粒對(duì)內(nèi)部所包裹的熒光染料有保護(hù)作用，使其熒光穩(wěn)定性增強(qiáng)，可以克服外界環(huán)境對(duì)熒光材料的影響［13］。其次，一個(gè)納米顆粒內(nèi)所包裹的熒光分子往往多達(dá)幾千甚至幾萬(wàn)個(gè)，因此，更多的熒光分子可以連接在生物分子上，當(dāng)產(chǎn)生信號(hào)響應(yīng)時(shí)，很多熒光分子同時(shí)產(chǎn)生熒光信號(hào)，起到了信號(hào)放大的作用，從而提高檢測(cè)靈敏度［14］。但這種納米顆粒存在內(nèi)部有機(jī)染料可能泄露的缺陷。在眾多嵌入式核殼熒光納米顆粒中，基于二氧化硅的納米顆粒由于其良好的生物修飾性、生物親和性和檢測(cè)靈敏度，近些年來(lái)發(fā)展迅速，并且逐漸擴(kuò)展應(yīng)用到生物分析的多個(gè)領(lǐng)域。

1.2.3碳點(diǎn)

碳點(diǎn)是一種近似球型且直徑小于10nm的零維半導(dǎo)體納米晶體，是由極少分子或是原子組成的納米團(tuán)簇［15］。熒光性能是碳點(diǎn)最突出的性能，碳點(diǎn)具有熒光穩(wěn)定性高、熒光波長(zhǎng)可調(diào)、抗光漂白能力強(qiáng)、激發(fā)光寬且連續(xù)、能夠?qū)崿F(xiàn)一元激發(fā)、多元發(fā)射等特點(diǎn)［16］。

制備碳點(diǎn)的碳源來(lái)源豐富且價(jià)廉、毒性低，常用的有蠟燭灰、天然氣燃燒產(chǎn)生的煙灰、活性炭、西瓜皮、檸檬酸等。利用碳點(diǎn)表面的—NH2和—OH，在碳點(diǎn)表面接上對(duì)生物分子有特異性識(shí)別作用的核酸適體或分子印跡聚合物，可提高分析的靈敏度和選擇性［17］。在蛋白質(zhì)研究中，碳點(diǎn)通過(guò)與蛋白質(zhì)的作用，改變了表面電子空穴對(duì)之間的復(fù)合效率，從而發(fā)生熒光的增強(qiáng)或猝滅，實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的標(biāo)記和分析。

1.2.4碳納米管

碳納米管是由單層或多層類似六邊形網(wǎng)格結(jié)構(gòu)的石墨烯片卷曲而成的中空納米管狀物。碳納米管的管徑通常為幾埃到幾十納米，長(zhǎng)卻可以達(dá)到幾十微米到幾毫米。多壁碳納米管每層之間保持著固定的距離，約為0.34nm［18］。

O’Connell等［19］研究發(fā)現(xiàn)，單根分散的單壁碳納米管能夠在近紅外波段吸收光子并發(fā)出熒光。碳納米管發(fā)射的熒光是由于其表面存在較多缺陷，可以捕獲激發(fā)光的能量，屬于能帶間隙的光致發(fā)光。碳納米管的長(zhǎng)度越短，發(fā)光強(qiáng)度越大，原因在于長(zhǎng)度越短，缺陷越多，其最低空軌道和最高占有軌道之間的能隙增大，捕獲激發(fā)光的能量增強(qiáng)，因而發(fā)射的熒光也隨之增強(qiáng)［20］。但是由于碳納米管具有巨大的相對(duì)分子質(zhì)量和很強(qiáng)的管間作用，容易團(tuán)聚而導(dǎo)致熒光猝滅，且很難分散于水和其他溶劑中，這在一定程度上的限制了碳納米管的應(yīng)用。因此，碳納米管的功能化修飾是目前碳納米管研究領(lǐng)域中的一個(gè)重要方向［21］。碳納米管在蛋白質(zhì)研究領(lǐng)域的應(yīng)用在國(guó)內(nèi)并不常見(jiàn)，在國(guó)外主要集中在蛋白質(zhì)標(biāo)記成像方面。

1.2.5貴金屬元素納米簇

貴金屬元素納米簇的尺寸通常小于2nm，具有強(qiáng)的可見(jiàn)-近紅外熒光。同其他熒光納米材料相比，貴金屬元素納米簇更加穩(wěn)定，分散性更好。近幾年來(lái)，貴金屬納米簇分子橋的研究是一大熱點(diǎn)。在過(guò)去的研究里，分子橋通常需要氨基或巰基進(jìn)行連接，但是合成含有氨基或巰基的分子通常需要復(fù)雜的步驟。Komoto等［22］利用芳基碘化物作為金納米簇的連接分子，連接電極，構(gòu)成分子橋，研究了其導(dǎo)電性質(zhì)。由于金屬納米簇的低毒性，近紅外光譜特征，超小尺寸及優(yōu)良的熒光性質(zhì)，它們已廣泛用于蛋白質(zhì)檢測(cè)、標(biāo)記成像及蛋白質(zhì)間相互作用的研究領(lǐng)域。

1.2.6磁性熒光納米顆粒

磁性熒光納米顆粒是一種結(jié)合了磁性和發(fā)光性能的納米材料。磁性熒光納米材料集合了磁性納米顆粒的快速磁響應(yīng)性以及熒光材料的光致發(fā)光能力，在分離的同時(shí)還能進(jìn)行光學(xué)檢測(cè)。陳順等［23］利用Fe3O4磁性納米粒子和量子點(diǎn)的結(jié)合，制備了具有熒光性質(zhì)的磁性納米顆粒。采用表面活性劑修飾Fe3O4磁性納米粒子，經(jīng)質(zhì)子化后，F(xiàn)e3O4磁性納米粒子表面披覆大量正電荷，與表面帶負(fù)電荷的核殼CdSe/CdS/ZnS量子點(diǎn)通過(guò)強(qiáng)烈的靜電作用發(fā)生組裝，得到兼具磁性和熒光性能的磁性熒光納米材料。Sathe等［24］將Fe3O4和量子點(diǎn)包覆在硅殼內(nèi)，將合成的具有磁性的紅色量子點(diǎn)和沒(méi)有磁性的綠色量子點(diǎn)混合在一起，外加磁場(chǎng)并用蒸餾水沖洗，于熒光顯微鏡下觀察，沒(méi)有磁性的綠色量子點(diǎn)消失，視野中只剩下帶有磁性的紅色量子點(diǎn)?；谶@種方法可以設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)的快速分離。

從表1中可以看出，以上6種熒光納米材料的特點(diǎn)與特征、常見(jiàn)的表面功能修飾基團(tuán)以及其可以再蛋白質(zhì)研究方面的應(yīng)用領(lǐng)域。

表1　各種熒光納米材料的特點(diǎn)、常見(jiàn)的表面功能修飾以及其在蛋白質(zhì)研究方面的應(yīng)用Table1Characteristics and functional surface modification of fluorescence nanomaterials，and their applications in protein research

2　熒光納米材料在蛋白質(zhì)分析中的應(yīng)用

2.1蛋白質(zhì)標(biāo)記成像

2.1.1熒光納米材料標(biāo)記蛋白質(zhì)的原理與條件

傳統(tǒng)染料分子在進(jìn)行活體熒光成像時(shí)，會(huì)在體內(nèi)循環(huán)而導(dǎo)致被測(cè)活體全身均有熒光，使得背景信號(hào)高，干擾作用強(qiáng)，靶向性差。而熒光特性良好的納米材料可以實(shí)現(xiàn)特異性地標(biāo)記蛋白質(zhì)。為了能與蛋白質(zhì)相連，必須對(duì)納米材料的表面進(jìn)行親水性修飾。以半導(dǎo)體納米晶體為例，目前主要采用兩種方法實(shí)現(xiàn)納米材料表面的功能化。一種是利用納米晶體表面的元素如Zn、Cd等與巰基之間強(qiáng)絡(luò)合作用，使半導(dǎo)體納米晶體與巰基酸絡(luò)合帶上羧基，實(shí)現(xiàn)親水功能化［25］。另一種是將半導(dǎo)體納米晶體的表面包覆一層親水層的無(wú)機(jī)物，然后在表面修飾可與生物材料連接的官能團(tuán)，從而實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的標(biāo)記［26］。但對(duì)半導(dǎo)體納米晶體表面包覆一層物質(zhì)，發(fā)光強(qiáng)度往往會(huì)下降，并且操作的難度較大。

2.1.2熒光納米材料在蛋白質(zhì)標(biāo)記成像方面的應(yīng)用

由于納米材料生物相容性好、靶向性好、光學(xué)特性優(yōu)良，在熒光成像中得到了廣泛應(yīng)用。量子點(diǎn)最初用于生物領(lǐng)域便是標(biāo)記簡(jiǎn)單的生物大分子。2010年，Liu Jian等［27］利用多色量子點(diǎn)與CD15、CD30、CD45、Pax5這4種蛋白質(zhì)生物標(biāo)記物進(jìn)行結(jié)合，根據(jù)蛋白質(zhì)生物標(biāo)記物與特定蛋白質(zhì)的特異性相互作用，利用量子點(diǎn)—蛋白質(zhì)生物標(biāo)記物可以對(duì)B細(xì)胞、T細(xì)胞以及霍奇金淋巴瘤進(jìn)行多色成像，實(shí)現(xiàn)了多色量子點(diǎn)對(duì)蛋白質(zhì)的同步標(biāo)記成像。2010年，Li Qin等［28］將碳點(diǎn)表面鈍化，與轉(zhuǎn)鐵蛋白進(jìn)行標(biāo)記，得到了轉(zhuǎn)鐵蛋白共軛的碳點(diǎn)。將蛋白質(zhì)共軛和未共軛的碳點(diǎn)分別與HeLa細(xì)胞共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)前者標(biāo)記的細(xì)胞熒光明顯增強(qiáng)，證明了轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白標(biāo)記將有利于碳點(diǎn)通過(guò)細(xì)胞膜，增強(qiáng)其在細(xì)胞內(nèi)的成像作用。與CdSe/ZnS量子點(diǎn)相比，碳點(diǎn)在成像中遷移速度較慢［29］。

Welsher等［30］利用碳納米管在近紅外區(qū)產(chǎn)生的熒光進(jìn)行細(xì)胞成像。碳納米管與利妥昔單抗偶聯(lián)，通過(guò)抗體與細(xì)胞表面進(jìn)行特異性識(shí)別進(jìn)行成像。Xie Jianping等［31］于2008年合成了牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）標(biāo)記的近紅外金納米簇，這種被BSA包被的金納米簇結(jié)合體為貴金屬體內(nèi)成像提供了可能。之后，Wu Xu等［32］用這種近紅外BSA-金納米簇結(jié)合體在裸鼠體內(nèi)進(jìn)行成像，發(fā)出紅色熒光。該熒光光穩(wěn)定性良好，并且對(duì)小鼠沒(méi)有明顯毒性。碳納米管和金納米簇這兩種方法的突出優(yōu)勢(shì)都是利用納米材料近紅外熒光，將材料熒光與背景熒光很好的區(qū)分開來(lái)，干擾較小。

2.2蛋白質(zhì)相互作用的研究

2.2.1研究蛋白質(zhì)相互作用的意義及技術(shù)方法

蛋白質(zhì)間相互作用控制著生命的各個(gè)過(guò)程，是整個(gè)生命體結(jié)構(gòu)和生命活動(dòng)的基礎(chǔ)。目前，研究蛋白質(zhì)相互作用的常規(guī)方法主要有化學(xué)交聯(lián)法、免疫共沉淀法、酵母雙雜交法和噬菌體展示法等。一些生物物理學(xué)方法也逐漸得到應(yīng)用，有蛋白質(zhì)熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)、綠色熒光蛋白質(zhì)近似成像技術(shù)和質(zhì)譜等［33］。隨著納米技術(shù)的發(fā)展，熒光納米材料也逐漸應(yīng)用到了蛋白質(zhì)相互作用研究中。

2.2.2熒光納米材料在蛋白質(zhì)相互作用方面的應(yīng)用

在蛋白質(zhì)相互作用的研究中，熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)是一種常用的分析技術(shù)。熒光共振能量轉(zhuǎn)移是指運(yùn)用熒光蛋白、傳統(tǒng)有機(jī)染料或其他新材料作為能量供體與能量受體，以適當(dāng)頻率的光能照射供體，產(chǎn)生振蕩偶極子，與近處的受體探針的偶極子產(chǎn)生共振。這種共振作用會(huì)將供體熒光團(tuán)的能量非放射性地轉(zhuǎn)移到受體熒光團(tuán)。熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)作為一種高效的光學(xué)“分子尺”，具有高分辨率、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)。Wang Shaopeng等［34］在2002年利用量子點(diǎn)共振能量轉(zhuǎn)移原理，研究了BSA和抗BSA抗體（IgG）的特異性結(jié)合。分別用紅、綠兩種量子點(diǎn)標(biāo)記BSA和IgG，根據(jù)BSA與IgG免疫相互作用，BSA和IgG形成免疫復(fù)合物。這種免疫復(fù)合物導(dǎo)致紅綠量子點(diǎn)之間發(fā)生共振能量轉(zhuǎn)移，BSA上的紅色量子點(diǎn)的熒光相對(duì)增強(qiáng)，IgG上的綠色量子點(diǎn)熒光相對(duì)減弱。當(dāng)免疫復(fù)合物中加入BSA時(shí)，它就會(huì)與量子點(diǎn)-BSA競(jìng)爭(zhēng)IgG上的結(jié)合位點(diǎn)，將量子點(diǎn)-BSA從免疫復(fù)合物上取代下來(lái)，阻止共振能量轉(zhuǎn)移的發(fā)生，熒光恢復(fù)。圖2顯示了熒光共振能量轉(zhuǎn)移導(dǎo)致了熒光變化情況。根據(jù)這種技術(shù)，可跟蹤了解抗原抗體免疫反應(yīng)的情況。

圖2競(jìng)爭(zhēng)性的BSA結(jié)合到免疫復(fù)合物形成的熒光共振能量轉(zhuǎn)移體系對(duì)熒光強(qiáng)度的影響［34］34Fig.2Effect of competitive BSA binding on fluorescence resonance energy transfer of the immunocomplex［34］

金納米簇也被報(bào)道用在蛋白質(zhì)相互作用研究上。王麗霞［35］研究了確定濃度的金納米簇與胰蛋白酶的相互作用機(jī)理。金納米簇的出現(xiàn)使胰蛋白酶發(fā)生自發(fā)熒光猝滅，隨著金納米簇濃度的增加胰蛋白酶熒光猝滅增強(qiáng)，利用Stern-Volmer方程確定了猝滅常數(shù)以及猝滅機(jī)理，推測(cè)金納米簇與胰蛋白酶結(jié)合反應(yīng)的猝滅機(jī)理很可能是復(fù)合物形成的靜態(tài)猝滅，而不是發(fā)生分子碰撞的動(dòng)態(tài)猝滅，通過(guò)計(jì)算可以得到金納米簇-胰蛋白酶體系的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。

2.3蛋白質(zhì)固定與分離

功能化的磁性納米顆粒標(biāo)記蛋白質(zhì)時(shí)，一方面能夠作為載體起到富集與固定的作用；同時(shí)，磁性納米顆粒在外加磁場(chǎng)的作用下，能夠快速有效地實(shí)現(xiàn)免疫復(fù)合物與未結(jié)合物的分離。蛋白質(zhì)與磁性納米粒子的結(jié)合和解離通過(guò)蛋白質(zhì)與磁性納米粒子表面的電荷來(lái)控制，在低pH值條件（pH＜pI）下，帶正電的蛋白質(zhì)被吸附在帶負(fù)電的磁性納米粒子表面；在較高的pH值（pH＞pI）下，帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)將被排斥離開磁性納米粒子的表面［36］。Bucak等［37］報(bào)道了Fe3O4磁性納米粒子用于蛋白質(zhì)混合物中單一蛋白質(zhì)的回收和分離。該磁性納米粒子的吸附容量大，運(yùn)用高梯度磁性過(guò)濾技術(shù)，不受其他共存物質(zhì)的干擾，沒(méi)有常用離子交換劑的傳輸阻力，很容易進(jìn)行蛋白質(zhì)回收。另外，基于磁性熒光雙功能納米材料在此領(lǐng)域也逐步得到了應(yīng)用，在實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)固定的同時(shí)可對(duì)多種物質(zhì)進(jìn)行可視分析檢測(cè)。王顯祥等［38］用CdTe量子點(diǎn)和超順磁性納米Fe3O4合成了熒光和磁性雙功能親水復(fù)合納米材料，并在這種復(fù)合納米材料表面固定了葡萄糖氧化酶?；谄咸烟茄趸复呋咸烟钱a(chǎn)生H2O2能夠引起量子點(diǎn)熒光的猝滅，實(shí)現(xiàn)了對(duì)樣品中葡萄糖的分離和快速可視化熒光檢測(cè)。

2.4快速超靈敏蛋白質(zhì)分析檢測(cè)

2.4.1基于熒光納米材料自身與蛋白質(zhì)的相互作用進(jìn)行檢測(cè)

蛋白質(zhì)的痕量分析檢測(cè)在食品、藥物及臨床分析中具有重要意義?；跓晒饧{米材料與蛋白質(zhì)的相互作用，利用納米材料的特殊熒光性質(zhì)，實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的精確、快速痕量分析。Cai Zhaoxia等［39-40］基于共振瑞利散射的原理，利用金納米粒子和摻雜Cd的ZnSe量子點(diǎn)為探針實(shí)現(xiàn)了雞蛋白中溶菌酶的超靈敏分析，檢測(cè)限可達(dá)納克級(jí)別。圖3是Cd摻雜ZnSe量子點(diǎn)和溶菌酶作用體系的共振瑞利散射光譜圖。當(dāng)量子點(diǎn)與溶菌酶結(jié)合后，由于共振瑞利散射作用，散射強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，該方法靈敏度高，檢測(cè)速度快。

圖3Cd摻雜的ZnSe量子點(diǎn)和溶菌酶作用系統(tǒng)的RRS光譜RRS［40］40Fig.3RRS spectra of Cd doped ZnSe QDs and lysozyme systems［40］

2.4.2基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)

基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)，也可以進(jìn)行蛋白質(zhì)的分析檢測(cè)。由于熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)具有光學(xué)“分子尺”的作用，故在蛋白質(zhì)分析檢測(cè)中具有更高的靈敏度。黃珊等［41］使用CdSe量子點(diǎn)，基于量子點(diǎn)與蛋白質(zhì)之間的能量轉(zhuǎn)移，建立了簡(jiǎn)單快速檢測(cè)溶菌酶的新方法。該法在0.01～0.8μmol/L的范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度與溶菌酶濃度呈很好的線性關(guān)系，檢測(cè)限為5.2nmol/L。

2.4.3基于特異性免疫反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)

基于抗原抗體間的免疫反應(yīng)，可以實(shí)現(xiàn)特定蛋白質(zhì)的定量檢測(cè)。Xu Bailu等［42］在2012年以葡萄糖為碳源制備出可溶于水的碳點(diǎn)，再分別用氨基修飾的凝血酶適體TBA15和TBA29修飾該碳點(diǎn)和SiO2納米顆粒，凝血酶便可與這兩者相互作用形成“碳點(diǎn)-凝血酶-SiO2納米顆?！眾A層結(jié)構(gòu)，隨著凝血酶濃度的增加，碳量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度增加，檢測(cè)限為1nmol/L。林卉［43］提出了根據(jù)金納米簇?zé)晒忖鐧C(jī)理，檢測(cè)無(wú)標(biāo)記木瓜蛋白酶檢測(cè)方法。木瓜蛋白酶對(duì)包覆在BSA-金納米簇表面的BSA的降解可引起B(yǎng)SA-金納米簇的聚集，進(jìn)而使BSA-金納米簇的熒光發(fā)生猝滅。熒光強(qiáng)度的變化對(duì)木瓜蛋白酶的濃度有很好的響應(yīng)，對(duì)木瓜蛋白酶的檢測(cè)限為0.07μg/mL。Ruan Xiaojuan等［44］通過(guò)ZnSe量子點(diǎn)，根據(jù)對(duì)牛分支桿菌表面的MPB83蛋白與其抗體之間的特異性免疫反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)MPB83蛋白的痕量分析，為牛分支桿菌的快速檢測(cè)提供了一種新思路。目前，基于免疫層析技術(shù)的量子點(diǎn)試紙條在醫(yī)學(xué)檢測(cè)方面的研究取得較大進(jìn)展。郭勤［45］利用CdTe量子點(diǎn)偶聯(lián)入葡萄球菌蛋白A，在免疫量子點(diǎn)的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了免疫層析試紙條檢測(cè)抗HIV-1gp41抗體，為熒光納米材料的商品化、便攜化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。這些方法通過(guò)免疫相互作用進(jìn)行蛋白質(zhì)測(cè)定，其特異性良好，干擾較小，可以方便快捷實(shí)現(xiàn)高通量的分析檢測(cè)。

3　結(jié)語(yǔ)

隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，蛋白質(zhì)研究技術(shù)也在不斷地發(fā)展、進(jìn)步和完善。熒光納米材料作為近些年來(lái)極具發(fā)展?jié)摿Φ男滦筒牧希云涮厥獾墓鈱W(xué)性質(zhì)在蛋白質(zhì)應(yīng)用研究中顯示出獨(dú)特的優(yōu)越性?；诙喾N新型的熒光納米材料的熒光特性，可用于蛋白質(zhì)快速分析檢測(cè)、蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)標(biāo)記成像等多個(gè)方面。磁性熒光納米顆粒現(xiàn)已有成熟的合成方法，但在蛋白質(zhì)研究方面應(yīng)用還不夠廣泛，基于其良好的熒光性與磁性，未來(lái)應(yīng)用前景也將十分廣闊?？傊?，熒光納米材料由于其特殊的光學(xué)和電學(xué)性質(zhì)，將會(huì)在蛋白質(zhì)領(lǐng)域有著更廣泛的應(yīng)用價(jià)值和發(fā)展前景，將會(huì)應(yīng)用于蛋白質(zhì)的各個(gè)領(lǐng)域并帶來(lái)革命性的進(jìn)步。

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Recent Progress in Fluorescence Nanomaterial Application in the Field of Protein Analysis

WANG Qi，WANG Beibei，MA Meihu，CAI Zhaoxia*
（National Research and Development Center for Egg Processing，College of Food Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan430070，China）

Protein plays an important role in human metabol ism，immunity and disease occurrence.At present，proteins have been studied in the fields of biology，medicine，food and others.The technologies used for protein research have become the focus of worldwide attention.Developing functional fluorescent nano-materials with good optical properties and biocompatibility is of great significance for the labeling，analysis and separation of protein.In this paper，the basic properties of fluorescent nano-materials are outlined，such as semiconductor quantum dots，embedded core-shell nanoparticles，carbon dots，carbon nanotubes，precious metal element nano-clusters，and fluorescent magnetic nanoparticles.We also review the applications of these kinds of nano-materials in protein marker imaging，protein interaction，protein immobilization and separation，and protein detection.

fluorescence；nanometer materials；protein；application

O65

A

1002-6630（2015）05-0221-06

10.7506/spkx1002-6630-201505041

2014-05-22

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31371810）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（2013PY036）

王琪（1993—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：401384873@qq.com

蔡朝霞（1979—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩c分析。E-mail：caizhaoxia@mail.hzau.edu.cn