張樂，朱虹，2，韋坤華，張春紅，2，李旻輝，2*

(1.內蒙古科技大學包頭醫(yī)學院，內蒙古 包頭 014060；2.內蒙古自治區(qū)特色藥用植物培育與保護工程技術研究中心，內蒙古 包頭 014060；3.廣西壯族自治區(qū)藥用植物園，廣西藥用資源保護與遺傳改良重點實驗室，廣西 南寧 530023)

·基礎研究·

沙苑子與其混偽品的ITS序列分子鑒別研究△

張樂1，朱虹1，2，韋坤華3，張春紅1，2，李旻輝1，2*

(1.內蒙古科技大學包頭醫(yī)學院，內蒙古 包頭 014060；2.內蒙古自治區(qū)特色藥用植物培育與保護工程技術研究中心，內蒙古 包頭 014060；3.廣西壯族自治區(qū)藥用植物園，廣西藥用資源保護與遺傳改良重點實驗室，廣西 南寧 530023)

目的：研究沙苑子與其混偽品之間的DNA分子鑒別方法。方法：采集不同產地的沙苑子藥材10份，基原植物2份，達烏里黃芪3份，蒙古黃芪4份，直立黃芪3份，混偽品豬屎豆和凹葉野百合各1份，所有樣品進行總DNA的提取，PCR擴增，并對擴增產物進行測序得到相應的序列，用MEGA計算其種間的K-2-P距離，最后利用ITS序列構建其系統(tǒng)發(fā)育樹。結果：測得了24份樣品的ITS序列全長，分別為沙苑子644～688 bp，蒙古黃芪為646～673 bp；直立黃芪685～687 bp；達烏里黃芪為676～688 bp；豬屎豆為785 bp；凹葉野百合為837 bp。通過以ITS序列重建系統(tǒng)進化樹進行的聚類分析可以將沙苑子與其混偽品有效的區(qū)分開。用MEGA軟件基于ITS序列構建的沙苑子與其混偽品間的遺傳距離分析得到了沙苑子與達烏里黃芪的種間K-2-P距離0.080 2；蒙古黃芪為0.081 2，與直立黃芪之間的遺傳距離為0.082 4，凹葉野百合和豬屎豆與沙苑子的遺傳距離稍大，達到0.236 2和0.229 9。用MEGA軟件測定沙苑子種內遺傳距離為0.001 0。此外，對通過測定種間的遺傳距離發(fā)現(xiàn)，蒙古黃芪與直立黃芪種間的遺傳距離最小為0.000 9，與豬屎豆種間的遺傳距離最大為0.236 2。結論：ITS序列能夠成功鑒定沙苑子及其混偽品，可以作為沙苑子與其混偽品的分子鑒別方法。

沙苑子；ITS序列；分子鑒別

沙苑子為豆科植物扁莖黃芪AstragaluscomplanatusR.Br.的干燥成熟種子，為臨床常用中藥，始載于《神農本草經》。傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論認為沙苑子具有溫補肝腎、固精、縮尿、明目的功能，用于腎虛腰痛、遺精早泄、白濁帶下、小便余瀝、眩暈目昏等[1]。隨著沙苑子有效成分的深入研究，沙苑子資源廣泛開發(fā)和利用，市場對沙苑子資源的需求急劇增加。通過調查發(fā)現(xiàn)近年來市場上除了正品沙苑子外，尚有偽品和混淆品存在，如直立黃芪種子、達烏里黃芪種子、蒙古黃芪種子、豬屎豆種子、凹葉野百合種子等，這些藥材在外形上與沙苑子極為相近，但在藥效方面相差甚遠，有些甚至具有毒性。因此，準確的鑒別沙苑子藥材對于保障人們用藥安全意義重大。

市面上銷售的沙苑子大多為加工過的藥材。由于沙苑子與其混偽品的性狀、顯微特征等都極為相似，因此在實際運用中要準確鑒別存在一定難度。同時應用形態(tài)學、組織學和化學成分分析等方法來鑒定沙苑子，具有主觀性較強、特異性較弱、通用性差、對觀察者經驗要求高等缺陷，不利于規(guī)范化、標準化方法的建立及普及。而DNA分子遺傳標記技術具有快速、微量、特異性強的特點，為藥材的鑒別提供了客觀而有效的手段[2-6]。本研究采用rDNA-ITS序列差異分析的方法，對沙苑子藥材和基源植物及其混偽品豬屎豆、達烏里黃芪、直立黃芪，蒙古黃芪和凹葉野百合的遺傳關系作深入的研究，為準確進行沙苑子與其混偽品的鑒別提供科學的客觀依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 儀器 PCR儀(德國Eppendorf型號5332)，電泳系統(tǒng)(北京市六一儀器廠，型號DYY-12)，低溫冷凍離心機(德國Eppendorf 型號5810 R)，紫外凝膠成像分析儀(英國Syngene型號GBOXHR)，混合型球磨儀(德國Retseh 型號MM400)，數控超聲波清洗器(型號KQ-SOODE)，微量移液器(德國Eppendorf)。

1.1.2 試劑 2 x CTAB提取液，1 x TAE緩沖液，瓊脂糖(Promega公司)，溴化乙錠(Flulka公司)，DNA Tag聚合酶(Takara公司)，2000 bp DNA Markar(Takara公司)，三氯甲烷、無水乙醇、異丙醇均為國產分析純。

1.1.3 供試樣品 實驗材料沙苑子種子及原植物、豬屎豆種子、達烏里黃芪種子、直立黃芪種子，蒙古黃芪種子等樣品均經內蒙古科技大學包頭醫(yī)學院李旻輝教授鑒定，采集信息見表1。沙苑子通常略呈腎形而稍扁，長2～2.5 mm，寬1.5～2 mm，厚約l mm。表面光滑，褐綠色或灰褐色，邊緣一側微凹處具圓形種臍。質堅硬，不易破碎。子葉2，淡黃色，胚根彎曲，長約l mm。氣微，味淡，嚼之有豆腥味。通過與當地藥材商進行核實確定，并根據藥材商進貨時留下的收據信息來核對樣品，進而保證對廣西、四川、河北等三個不同地區(qū)的沙苑子收集的準確性。

1.2 實驗方法

1.2.1 總DNA提取 取每份樣品單粒種子0.3 mg，研磨破碎裝入微量離心管中，加入適量預熱的2 x CTAB提取液，用振蕩器將樣品搖勻，加入適量巰基乙醇，混勻，放在65 ℃水浴鍋中水浴1.5 h，取出材料置于室溫下冷卻，加入適量氯仿-異戊醇(24∶1)溶液，用力搖勻5 min，高速離心10 min(12 000r·min-1)，取上清液，加入等體積的氯仿-異戊醇(24：1)溶液，用力搖勻 5 min，高速離心10 min，取上清液，加入適量異丙醇，輕輕顛倒2-3次，放在-20 ℃冰箱里靜置30 min，高速離心10 min，棄上清，用70%乙醇及無水乙醇分別洗2次，最后放在37 ℃烘箱中烘20～30 min，使乙醇揮發(fā)徹底，加入適量滅菌蒸餾水，使之溶解，放在-20 ℃或4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 實驗材料采集地

1.2.2 引物設計 選擇目前國際推薦的通用引物ITS(ITS4/ITS5)。

ITS4：5′-TCCTCCGCTTATT-GATATGC-3′；

ITSS：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAA-CAAGG-3′。

1.2.3 DNA擴增 反應體系總體積為25 μL，包括10 x buffer緩沖液2.5 μL，dNTP 1.0 μL，引物各2.5 μL，ExTag酶0.2 μL，DNA 1 μL，滅菌蒸餾水19.8 μL。反應條件：解鏈溫度95 ℃，時間5 min，退火溫度56 ℃，時間30 s，復性溫度72 ℃，時間1 min 40 s，延伸溫度72℃，時間7 min，循環(huán)次數為35個，最后4 ℃保存。

1.2.4測序 經過PCR擴增后，PCR原產物由北京擎科新業(yè)生物技術有限公司測序部測序，各樣品均采用雙向測序。

1.2.5 序列分析 將6種藥材的24個個體進行序列的比對分析，所得DNA序列用CONTIG軟件同源對齊，并輔以人工校對。以盡量減少排列所缺失的數口；排序后的序列使用BioEdit分析軟件進行分析處理。用MEGA 5分別計算各樣品ITS序列的差異性(Kimura 2-parameter)，并采用鄰接法(NJ法)和非加權平均法(UPGMA法)分別構建了系統(tǒng)發(fā)育樹。構建系統(tǒng)發(fā)育樹，并以Bootstrap作1000次可信度分析。

2 結果與分析

2.1 沙苑子與其混偽品的ITS序列特征

本實驗測得了沙苑子與其混偽品的24份樣品ITS序列，ITS全序列長度為644～837 bp，分別為沙苑子644～688 bp，其中(G+C)%為52.69%～53.34%；蒙古黃芪為646～673 bp，其中(G+C)%為46.51%～53.08%；直立黃芪685～687 bp，其中(G+C)%為52.11%～52.4%；達烏里黃芪為676～688 bp，其中(G+C)%為51.74%～52.42%；豬屎豆為785 bp，其中(G+C)%為58.22%；凹葉野百合為837 bp，其中(G+C)%為54.96%。

2.2 沙苑子與其混偽品間的遺傳距離分析

用MEGA軟件基于ITS序列構建的沙苑子與其混偽品間的遺傳距離分析得到了沙苑子與其混偽品蒙古黃芪、直立黃芪、達烏里黃芪、凹葉野百合及豬屎豆間的種間K-2-P距離，其中達烏里黃芪與沙苑子的種間K-2-P距離最小(0.080 2)；其次是蒙古黃芪為0.081 2)，直立黃芪與沙苑子之間的遺傳距離為(0.0824)，凹葉野百合和豬屎豆與沙苑子的遺傳距離稍大，達到0.236 2和0.229 9。(見表2)用MEGA軟件測定沙苑子種內遺傳距離為0.001 0。通過測定混偽品間K-2-P距離發(fā)現(xiàn)，蒙古黃芪與直立黃芪種間的遺傳距離最小為0.0009，與豬屎豆種間的遺傳距離最大為0.236 2(見表3)。

2.3 沙苑子與其混偽品系統(tǒng)發(fā)育樹構建

為了盡可能減少因系統(tǒng)誤差對所構建系統(tǒng)樹的影響，本實驗根據ITS序列特征采用NJ法和UPGMA法分別構建了系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1及圖2)。

表2 基于ITS序列構建的沙苑子與其混偽品間的遺傳距離

表3 基于ITS序列構建的混偽品的種間距離

圖1 基于ITS序列構建的沙苑子及混偽品的NJ樹

圖2 基于ITS序列構建的沙苑子與其混偽品的UPGMA樹

2種方法均采用Kimura 2-parameter距離，系統(tǒng)樹各分支的置信度用自展法(bootstrap method)檢驗，共進行1000次循環(huán)，以評價分支的統(tǒng)計學意義與可靠性。由圖1可以看出，通過NJ法建立的系統(tǒng)樹進行聚類可以分成3個大組，第1大組為不同產地沙苑子，第2大組為直立黃芪、達烏里黃芪及蒙古黃芪，其中直立黃芪和達烏里黃芪體聚在了一起，蒙古黃芪和直立黃芪以及達烏里黃芪能夠分開，第3大組為豬屎豆和凹葉野百合，其中在系統(tǒng)樹分支上可以看出，蒙古黃芪，達烏里黃芪及直立黃芪分支相比豬屎豆、凹葉野百合要近一些，說明它與沙苑子遺傳關系近些，達烏里黃芪和直立黃芪這2個物種在分類支上顯示遺傳關系也比較近些。通過系統(tǒng)樹聚類分析可以將沙苑子與其混偽品直立黃芪、蒙古黃芪、達烏里黃芪、豬屎豆和凹葉野百合有效鑒別開。結果表明ITS序列可以用于鑒別沙苑子與其混偽品，可以成為沙苑子與其混偽品鑒定分析的有效手段，對保證沙苑子藥材安全及植物資源合理利用具有重要意義。

3 討論

通過對購于市場上沙苑子藥材的調查結果表明：目前市售沙苑子主流商品為扁莖黃芪的種子，屬藥典規(guī)定品種，但在少數地區(qū)仍有混雜使用直立黃芪和紫云英的情況。在河北安國藥材市場，成都蓮花池及廣西玉林藥材市場上所收集的24份沙苑子藥材樣品中，并未出現(xiàn)曾報道過的凹葉野百合、田皂角、直立黃芪和華黃芪等充當沙苑子現(xiàn)象。

由于沙苑子屬較細小種子類，據報道沙苑子有多種混偽品，這些混偽品與正品種屬比較接近[7-8]，然而運用傳統(tǒng)的鑒別方法在藥材鑒定方面還未達到理想的快速、準確鑒定的目的。傳統(tǒng)的中藥材鑒定方法主要基于形態(tài)及化學特征，但是二者均受環(huán)境和生物生長發(fā)育等各種因素的限制，無法滿足中藥產業(yè)現(xiàn)代化發(fā)展的需求，DNA 條形碼技術具有較強的通用性，已作為藥用植物準確鑒定的重要手段，倍受國內外研究者的廣泛關注[9-11]。本研究采用DNA條形碼技術對市場上采購的沙苑子藥材進行鑒別。由于DNA濃度會直接影響PCR擴增效率，因此取樣過程中盡可能避免存有雜質，提高PCR擴增的效率。據K-2-P距離遺傳分析，正品沙苑子各基源植物種內平均K-2-P距離遠小于其與混偽品的種間K-2-P距離。因此ITS序列作為條形碼，能將沙苑子藥材與混偽品進行很好的區(qū)分，從而達到準確鑒定的目的。不僅為沙苑子藥用植物正本清源，保證藥材安全及植物資源合理利用提供保證，還是對傳統(tǒng)鑒別方法的有效補充和科學完善，對保障沙苑子藥材用藥安全具有重要意義。

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MolecularIdentificationofAstragaluscomplanatusanditsAdulterantsbyITSSequences

ZHANGLe1，ZHUHong1，2，WEIKunhua3，ZHANGChunhong1，LIMinhui1，2*

(1.BaotouMedicalCollege，Baotou，InnerMongolia014060，China；2.InnerMongoliaResearchCenterofCharacteristicMedicinalPlantsCultivationandProtectionEngineeringTechnology，Baotou，InnerMongolia014060，China；3.GuangxiKeyLaboratoryofMedicinalResourcesProtectionandGeneticImprovement，GuangxiBotanicalGardenofMedicinalPlants，Nanning530023，China)

Objective：To explore a new method for identification ofAstragaluscomplanatusfrom its adulterants by using ITS sequences.Methods：10 samples of the differentA.complanatusand 2 samples of original plant，3 samples ofA.dahuricus，4 samples of theA.membranaceusvar.mongholicus，3 samples ofA.adsurgens，1 sample of theCrotalariapallidaandC.retusawere collected.ITS sequence was amplified by PCR and sequenced unidirectionally.The interspecific genetic distances among 6 species ofA.complanatusand its adulterants were calculated，and NJ tree and UPGMA tree were constructed by MEGA 5.Among them，A.membranaceusvar.mongholicusandA.dahuricusinterspecific K-2-P minimum distance was 0.080 2，and then followed byA.membranaceusvar.mongholicus.A.adsurgensinterspecific was 0.082 4，C.pallidaandC.retusainterspecific was 0.236 2 and 0.229 9，respectively.In addition，A.complanatusintraspecific genetic distance was 0.003 0 computed by MEGA 5.0.Accoding to determination ofA.complanatusadulterants，it showed thatA.membranaceusvar.mongholicusandA.dahuricusinterspecific K-2-P minimum distance was 0.000 9 andC.pallidawas 0.236 2.Results：ITS sequences were obtained from 24 samples respectively，there wereA.complanatus644-688 bp，A.membranaceusvar.mongholicus664-673 bp，A.adsurgens685-687 bp，A.dahuricus676-688 bp，C.pallida785 bp andC.retusa837 bp.Phylogeny tree reconstruction using NJ and UPGMA analysis based on ITS nucleotide sequences can effectively distinguishA.complanatusfrom adulterants.Conclusion：ITS sequences can be used to identifyA.complanatusfrom its adulterants successfully and is an efficient molecular marker for authentication ofA.complanatusand its adulterants.

Astragaluscomplanatus；ITS sequences；molecular identification

2015-03-25)

“十二五”國家科技支撐計劃項目(2012BAI28B02)；包頭市科技計劃項目(2013X2001)；中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(201407003)

*

李旻輝，教授，研究方向：中藥資源、蒙藥研究；Tel：(0472)7167739，E-mail：li_minhui@aliyun.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.7.006