張立國，趙麗麗，倪力軍*，吳婷婷，史萬忠

(1.華東理工大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院，上海 200237；2.上海中醫(yī)藥大學(xué) 附屬曙光醫(yī)院，上海 200021)

·基礎(chǔ)研究·

腰痛寧膠囊有效部位組合對IL-1β誘導(dǎo)大鼠滑膜細胞增殖及IL-6的影響△

張立國1，趙麗麗1，倪力軍1*，吳婷婷1，史萬忠2

(1.華東理工大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院，上海 200237；2.上海中醫(yī)藥大學(xué) 附屬曙光醫(yī)院，上海 200021)

目的：研究腰痛寧膠囊組方有效部位的不同組合對IL-1β誘導(dǎo)的大鼠滑膜細胞異常增殖和對細胞因子IL-6分泌的影響，以及各有效部位之間的相互作用關(guān)系。方法：大鼠滑膜細胞株RSC-364體外培養(yǎng)傳至第2代后，加入腰痛寧拆方及全方共計6個腰痛寧有效部位組合樣品，培養(yǎng)48 h，采用CCK-8以及ELISA法分別測定滑膜細胞增殖及IL-6分泌水平。結(jié)果：6個腰痛寧拆方及組方樣品均能夠抑制滑膜細胞異常增殖以及IL-6的分泌，腰痛寧全方的綜合活性最佳且其有效部位間存在很強的協(xié)同作用。結(jié)論：腰痛寧膠囊可有效抑制大鼠滑膜炎，對滑膜細胞具有一定保護作用，腰痛寧膠囊的藥引黃酒對于腰痛寧處方中有效部位的細胞活性有重要的促進作用。但可在保證藥效前提下減少組方中藥或有效部位種類對腰痛寧處方進行精簡優(yōu)化，以增強其質(zhì)量可控性與安全性。

腰痛寧膠囊；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；細胞增殖；IL-6；滑膜細胞

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthrits，RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎為特征的慢性自身免疫功能障礙性疾病，滑膜細胞的過度增生以及大量炎癥因子的形成會導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的破壞[1]。白介素-6(interleukin-6，IL-6)的過量分泌是RA病理作用之一，因此，抑制細胞的異常增殖，以及有效封鎖IL-6可控制RA病情的發(fā)展[2-3]。腰痛寧是一個有幾十年臨床應(yīng)用歷史的中藥復(fù)方制劑，由馬錢子粉(調(diào)制)、土鱉蟲、麻黃、乳香、沒藥、川牛膝、全蝎、僵蠶、蒼術(shù)、甘草組成，使用時用黃酒兌少量溫開水服用[4]，用于腰腿疼、腰肌勞損和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病的治療[5]。腰痛寧處方中眾多的組方中藥給其藥理研究帶來很大困難。本課題組前期采用細胞模型研究了含腰痛寧有效部位在內(nèi)的中藥有效部位組合樣品的免疫、抗炎和軟骨細胞修復(fù)活性，并對樣品中有效部位間的相互作用類型進行了分析，結(jié)果表明腰痛寧全方具有修復(fù)骨性關(guān)節(jié)炎對軟骨造成的損傷[6-7]、良好的抗炎活性[8-9]與細胞免疫活性[10]，在這些藥理模型下腰痛寧全方中各有效部位間存在協(xié)同或疊加作用。

本文利用IL-1β誘導(dǎo)大鼠滑膜細胞建立體外類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病理模型[11]，探究腰痛寧不同有效部位組合樣品對滑膜細胞增殖及細胞中IL-6水平的影響，從細胞藥理角度研究腰痛寧有效部位組合對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用機制。

1 材料

1.1 細胞株

大鼠滑膜細胞株RSC-364(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀區(qū)中心醫(yī)院實驗中心惠贈)。

1.2 藥物

制馬錢子(批號：Y302-09091-10)、蒼術(shù)(批號：Y002-101001-2)、麻黃(批號：Y412-100601-12)、土鱉蟲(批號：Y803-110101-5)、川牛膝(批號：Y012-110401-1)、僵蠶(批號：Y805-1011054)、甘草(批號：Y013-110301-1)、乳香(批號：110301-2)、沒藥(批號：110401-1)、全蝎(批號：Y804-11302-4)、黃酒(批號：291110)，均由頸復(fù)康藥業(yè)集團有限公司提供，經(jīng)該公司執(zhí)業(yè)藥師王春民鑒定，樣本保存于華東理工大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院分析化學(xué)實驗室，各有效部位的提取及質(zhì)量分析方法見本實驗室前期工作報道[6]。按照各有效部位對應(yīng)中藥在腰痛寧中的投料量，將黃酮、皂苷、揮發(fā)油(含水提液)、多糖、黃酒提取物等活性部位依次加入馬錢子與麻黃生物堿中，制備6個腰痛寧拆方及全方樣品。樣品Ⅰ：馬錢子生物堿-麻黃生物堿混合物(1∶16)，生物堿混合物簡稱A；樣品Ⅱ：麻黃生物堿-馬錢子生物堿-甘草黃酮(1∶16∶3)，甘草黃酮簡稱F；樣品Ⅲ：麻黃生物堿-馬錢子生物堿-甘草黃酮-甘草皂苷-川牛膝皂苷(1∶16∶3∶5∶1)，皂苷類混合物簡稱S；樣品Ⅳ：麻黃生物堿-馬錢子生物堿-甘草黃酮-甘草皂苷-川牛膝皂苷-沒藥揮發(fā)油-乳香揮發(fā)油-蒼術(shù)揮發(fā)油-土鱉蟲水提液-僵蠶水提液-全蝎水提液(1∶16∶3∶5∶1∶4∶4∶3∶7∶7∶7)，揮發(fā)油/水提物混合物簡稱Ⅴ；樣品Ⅳ：麻黃生物堿-馬錢子生物堿-甘草黃酮-甘草皂苷-川牛膝皂苷-沒藥揮發(fā)油-乳香揮發(fā)油-蒼術(shù)揮發(fā)油-土鱉蟲水提液-僵蠶水提液-全蝎水提液-川牛膝多糖-甘草多糖-蒼術(shù)多糖-麻黃多糖(1∶16∶3∶5∶1∶4∶4∶3∶7∶7∶7∶5∶7∶2∶3)，多糖類混合物簡稱P；樣品Ⅵ：麻黃生物堿-馬錢子生物堿-甘草黃酮-甘草皂苷-川牛膝皂苷-沒藥揮發(fā)油-乳香揮發(fā)油-蒼術(shù)揮發(fā)油-土鱉蟲水提液-僵蠶水提液-全蝎水提液-川牛膝多糖-甘草多糖-蒼術(shù)多糖-麻黃多糖-黃酒提取物(1∶16∶3∶5∶1∶4∶4∶3∶7∶7∶7∶5∶7∶2∶3∶1)，黃酒提取物簡稱Crw。

1.3 試劑

磷酸鹽緩沖液片劑(PBS Tablets，瑞典Medicago AB公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基，0.25% 胰酶，雙抗(鏈霉素與青霉素)，兩性霉素(美國Biowest公司)；Rat IL-1素(以色列PROSPEC公司)；小牛血清(FBS，美國Gibco公司)；大鼠IL-6 ELISA試劑盒(美國RD System公司)；CCK8試劑盒(日本同仁化學(xué))。

1.4 主要儀器

CO2培養(yǎng)箱(cell 150，德國Heraeus公司)；倒置顯微鏡(CKX41，日本OLYMPUS公司)；TXZ-92B臺式恒溫振蕩器(上海賀德實驗設(shè)備廠)；離心機(TDZ4-WS，湖南賽特湘儀)；生物安全柜(美國LABCONCO公司)；酶標儀(EL-340，意大利Bioteck公司)；分析天平(瑞士METTER TOLEDO公司)；恒溫磁力攪拌器(上海司樂儀器有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式多用真空泵(上海予華儀器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司)；數(shù)顯調(diào)節(jié)儀(余姚新波儀器公司)；真空干燥箱(上海一恒科技有限公司)；超聲儀(上海生析超聲儀器有限公司)。

2 方法

2.1 受試樣品配置

首先精密稱取各中藥有效部位，將具有熱穩(wěn)定性的有效部位置于燒杯中，加入適量PBS緩沖液，攪拌使之初步溶解，沸水浴加熱10 min，待其完全溶解后冷卻并加入熱不穩(wěn)定性有效部位進行混合。將腰痛寧拆方及全方樣品Ⅰ-Ⅵ分別超聲20 min，冷卻，定容，配成2500 mg·L-1母液，0.22 μm濾膜過濾并稀釋至各濃度(9.77、4.88、2.44、1.22、0.61、0.31、0.15、0.08 mg·L-1)，備用。

2.2 細胞培養(yǎng)與分組

本實驗采用大鼠滑膜細胞株RSC-364，待細胞基本長滿后傳代培養(yǎng)，傳至第2代時，調(diào)整細胞濃度為1×107·L-1，接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)用于實驗。每孔接種200 μL細胞懸液，接種24 h后把培養(yǎng)孔分為空白對照組、IL-1β對照組、受試樣品組，每樣3復(fù)孔，分別更換相應(yīng)的培養(yǎng)液：空白對照組換DMEM(含5%FBS、0.02%聚山梨酯-80)，模型組換DMEM(含10 μg·L-1的IL-1β、0.02%聚山梨酯-80及5%FBS)，受試藥物換DMEM(含10 μg·L-1的IL-1β、0.02%聚山梨酯-80、5%FBS及各濃度藥物)，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

2.3 細胞增殖檢測

于96孔板進行檢測，去除原有細胞培養(yǎng)基，每孔加入100 μL CCK8溶液(含100 μL全培養(yǎng)基及10 μL CCK8試劑)，繼續(xù)孵育，于給藥后3 h置于酶標儀450 nm波長下測定每孔的光密度值(OD值)，并換算半數(shù)抑制濃度(IC50)，除此之外，通過繪制標準曲線將OD換算成細胞數(shù)，對各受試樣品抑制增殖作用進行分析與比較。

2.4 細胞上清液中的IL-6的測定

取前述增殖細胞中原細胞培養(yǎng)基上清液，于96孔板進行檢測，全流程嚴格按照RD ELISA IL-6試劑盒操作說明書進行，使用酶標儀測得吸光度(A)，需將IL-6分泌水平根據(jù)對應(yīng)的細胞的數(shù)量進行歸一化處理，獲得單個細胞IL-6釋放量。最后，將IL-6值通過計算換算為IC50，分析及比較各樣品對滑膜細胞上清液內(nèi)IL-6水平的影響。

2.5 數(shù)據(jù)處理方法[6-10]

所得的實驗數(shù)據(jù)均以半數(shù)抑制濃度(IC50)±標準差(SD)表示，該值為各指標抑制率達到50%所對應(yīng)的藥物濃度，由各樣品量效曲線結(jié)合Origin7.5軟件作圖得到，數(shù)據(jù)則通過SPSS18.0進行單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。為了判斷各有效部位之間是協(xié)同、疊加還是拮抗作用，本文通過比較樣品的IC50實驗值與樣品中各有效部位IC50的疊加值間的差異來判斷有效部位間的相互作用關(guān)系。具體方法如下：首先，定義第i個有效部位在樣品j中的所占的質(zhì)量比為Xij，該有效部位的IC50值記為IC50(i)，將樣品j中每個有效部位IC50與其在樣品中的質(zhì)量比Xij乘積的和稱為樣品j的IC50疊加值，記為IC50(Aj)，即

IC50(Aj)=∑iXijIC50(i)

(1)

將樣品j的實驗IC50值記作IC50(Ej)、其標準差記為SD(j)。假設(shè)樣品j中的各有效部位間不存在相互作用，則IC50(i)可通過求解obj的極小值獲得：

obj=‖∑iXijIC50(i)-IC50(Ej)‖

(2)

1)若IC50(Ej)-SD(j)﹥IC50(Aj)，即樣品j中有效部位IC50的疊加值小于實驗IC50值，說明各有效部位間發(fā)生了拮抗作用；

2)若IC50(Ej)+SD(j)﹤IC50(Aj)，即樣品j中有效部位IC50的疊加值大于實驗IC50值，說明各有效部位間發(fā)生了協(xié)同作用；

3)若IC50(Ej)-SD(j)﹤IC50(Aj)﹤IC50(Ej)+SD(j)，即樣品j中有效部位的疊加值在IC50的波動范圍內(nèi)，說明各有效部位間存在疊加作用。

以上計算過程通過在MATLAB 2012b的自編程序?qū)崿F(xiàn)，詳細代碼見文獻的補充材料[8]。

3 結(jié)果與討論

3.1 各有效部位對IL-1β誘導(dǎo)的滑膜細胞增殖以及IL-6水平的影響

采用2.5所述方法計算得到的腰痛寧組方中15個有效部位抑制病理滑膜細胞增殖的IC50值以及IL-6的IC50值，見表1。各有效部位的IC50值與其在組方樣品中所占的比例的乘積加和，可求得I～VI號樣品的IC50疊加值。

表1 腰痛寧各有效部位抑制滑膜細胞增殖以及IL-6水平的IC50 /mg·L-1

3.2 各腰痛寧樣品對IL-1β誘導(dǎo)的滑膜細胞增殖的影響

如圖1所示，腰痛寧拆方與全方6個樣品對IL-1β誘導(dǎo)的滑膜細胞過度增殖均顯示出抑制作用。其中有兩種生物堿組成的拆方樣品Ⅰ作用最佳，其次是拆方樣品Ⅳ及全方樣品Ⅵ，三者之間無顯著差異。這與文獻報道馬錢子生物堿對包括滑膜細胞在內(nèi)的多種細胞增殖具有良好的抑制作用一致[12-13]。比較樣品Ⅱ與樣品Ⅰ、樣品Ⅴ與樣品Ⅳ，發(fā)現(xiàn)甘草黃酮、總多糖加入后的組方抑制滑膜細胞增殖作用顯著降低；比較樣品Ⅳ與樣品Ⅲ、樣品Ⅵ與樣品Ⅴ后，發(fā)現(xiàn)加入揮發(fā)油/水提物、黃酒提取物后的組方抑制滑膜細胞增殖的作用顯著提高。

將各樣品的實驗IC50值與其IC50疊加值進行比較發(fā)現(xiàn)，Ⅰ號、Ⅳ號與Ⅵ號樣品的IC50(Ej)+SD(j)大大低于其IC50(Aj)，說明這3個樣品中的各有效部位之間發(fā)生了很強的協(xié)同作用，使得這3個樣品的實驗IC50值在6個樣品中偏低；而Ⅱ號樣品的IC50(Ej)-SD(j)﹤IC50(Aj)﹤IC50(Ej)+SD(j)，說明Ⅱ號樣品的甘草黃酮與馬錢子生物堿以及麻黃生物堿間發(fā)生了疊加作用；Ⅴ號樣品的IC50(Ej)-SD(j)遠遠大于IC50(Aj)，說明該樣品的各有效部位之間存在極強的拮抗作用，因而Ⅴ號樣品的IC50為6個樣品中最高。Ⅲ號樣品的IC50(Ej)-SD(j)略大于其疊加IC50(Aj)，表明該樣品有效部位(生物堿、黃酮、皂苷)間有微弱的拮抗作用，且Ⅳ號樣品的實驗IC50顯著低于Ⅲ號樣品的IC50，表1結(jié)果說明揮發(fā)油/水提物抑制滑膜細胞增殖的活性遠遠強于其他有效部位，加上該部位與腰痛寧組方中藥生物堿、黃酮、皂苷間的協(xié)同作用，使得揮發(fā)油/水提物加入組方Ⅲ后得到的樣品Ⅳ抑制滑膜細胞增殖的活性得到顯著提高。

注：與Ⅰ相比，☆P<0.01；與Ⅲ相比，★P<0.05；與Ⅳ相比，#P<0.01；與Ⅴ相比，▲P<0.01；與Ⅵ相比，*P<0.05，**P<0.01。圖1 腰痛寧拆方及全方樣品對滑膜細胞增殖的影響

3.3 各腰痛寧樣品對IL-6分泌水平的影響

圖2列出了腰痛寧拆方與全方樣品對IL-1β誘導(dǎo)的滑膜細胞上清液中IL-6水平影響的半數(shù)抑制濃度實驗值與疊加值。6個樣品對病理滑膜細胞上清液中IL-6的分泌均有不同程度的抑制作用。其中，Ⅳ號樣品的作用最為顯著，Ⅴ號與Ⅵ號方次之，三者之間的IC50沒有統(tǒng)計學(xué)差異。Ⅰ號樣品由馬錢子與麻黃兩種生物堿組成，其IC50(Ej)+SD(j)

注：與Ⅰ相比，☆P<0.01；與Ⅱ相比，★P<0.01；與Ⅲ相比，△P<0.01；與Ⅵ相比，*P<0.01。圖2 腰痛寧拆方及全方樣品對滑膜細胞上清液中IL-6分泌水平的影響

4 結(jié)論

本文研究的6個腰痛寧膠囊組方有效部位組合樣品均對大鼠RA滑膜細胞炎癥有一定的抑制作用，主要表現(xiàn)在對異常增生滑膜細胞的抑制作用及下調(diào)炎癥因子IL-6的表達，從而抑制炎性滑膜細胞的炎性反應(yīng)。腰痛寧組方中藥中的揮發(fā)油/水提物及腰痛寧藥引黃酒具有良好的促進腰痛寧有效部位組合樣品抑制病理滑膜細胞增殖和滑膜細胞炎癥的作用。其中腰痛寧全方樣品Ⅵ在兩個滑膜細胞模型中均具有很好的藥理活性，從滑膜細胞藥理角度證明了腰痛寧膠囊的療效及處方的合理性。從精簡處方、提高藥物質(zhì)量可控性與安全性的角度而言，腰痛寧處方仍有一定的優(yōu)化空間，如以Ⅲ號或Ⅳ號樣品為基礎(chǔ)減少腰痛寧處方的中藥或有效部位種類，可為開發(fā)風(fēng)濕骨病中藥新藥提供新的候選藥物。

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Inhibition Effect of Active Fractions in Yaotongning Capsules on IL-1β-induced Synovial Cell Proliferation and IL-6Production

ZHANG Liguo1，ZHAO lili1，NI Lijun1*，WU Tingting1，SHI Wanzhong2

(1.School of Chemistry and Molecular Engineering，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237，China；2.Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of TCM，Shanghai 200021，China)

Objective：To evaluate theinvitroeffects and interactions of active fractions in Yaotongning Capsule (YTNC) by detecting proliferation of interleukin-6 (IL-6) and secretion of rat synovial cell-364 (RSC-364)induced by interleukin-1β(IL-1β).Methods：Six samples including YTNC disassembled prescriptions and the YTNC whole recipe were added to the second generation of culturing RSC-364.After culturing the system for 48 hours，the proliferations of synovial cells and interleukin-6 were examined by cell counting kit-8 (CCK8) assay and enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)，respectively.Results：The YTNC whole recipe and YTNC disassembled prescriptions successfully inhibited abnormal proliferation of IL-1β-induced synovial cells，as well as the secretion of IL-6.The YTNC whole recipe showed the best integrated activity among the six samples，and strong synergistic effect was observed among the active fractions of the YTNC whole recipe.Conclusion：YTNC prescription can inhibit rat synovitis deterioration and protect synovial cells to some degree.Moreover，the effects of the combination of YTNC material medicines’ active fractions on the investigated cell activities are obviously stimulated by YTNC’s vehicle，Chinese rice wine.However，in order to improve quality controllability and safety of YTNC without decreasing its efficacy，the categories of material medicines and active fractions in YTNC could still be reduced to get more simple prescriptions.

Yaotongning Capsule；rheumatoid arthritis；proliferation；IL-6；synovial cells

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.9.010

2014-11-17)

上海市科學(xué)技術(shù)委員會支撐項目(13401901100)

*

倪力軍，博士，教授，研究方向：天然藥物研究；Tel：(021)64253045，E-mail：nljfyt@163.com