龐晶瑤，李雨萌，柏兆方，趙艷玲，趙奎君，馬致潔*，王伽伯*，肖小河

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院，北京 100050；2.解放軍302醫(yī)院 全軍中藥研究所，北京 100039；3.云南中醫(yī)學院 中藥學院，云南 昆明 650500)

·基礎研究·

基于高內(nèi)涵分析的何首烏對肝竇內(nèi)皮細胞損傷的配伍減毒研究△

龐晶瑤1，2，李雨萌3，柏兆方2，趙艷玲2，趙奎君1，馬致潔1*，王伽伯2*，肖小河2

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院，北京 100050；2.解放軍302醫(yī)院 全軍中藥研究所，北京 100039；3.云南中醫(yī)學院 中藥學院，云南 昆明 650500)

目的：觀察何首烏對肝竇內(nèi)皮細胞損傷的配伍減毒情況，為其臨床合理用藥提供參考。方法：采用高內(nèi)涵分析技術，檢測何首烏與茯苓、甘草、三七在肝竇內(nèi)皮細胞上的配伍減毒情況。結(jié)果：何首烏對肝竇內(nèi)皮細胞的損傷呈劑量依賴性，在IC50的劑量下，分別配伍不同濃度的茯苓、甘草、三七都有顯著的減毒作用，且呈劑量依賴性。何首烏配伍茯苓減毒的效果較好，甘草次之，三七稍差。結(jié)論：采用高內(nèi)涵分析方法更加直觀、具體地反映何首烏與茯苓、甘草、三七的配伍減毒效果，為臨床用藥的安全性、合理性提供依據(jù)。

何首烏；配伍減毒；肝竇內(nèi)皮細胞；高內(nèi)涵分析

近年來，臨床上服用何首烏致肝損傷的病例日益增多，作為“四大仙草”之一的常用補益類中藥，何首烏的安全性受到質(zhì)疑。2013年10月、2014年7月我國食品藥品監(jiān)督管理總局(CFDA)相繼出臺關于何首烏及其相關制劑的通告，提示口服何首烏及其成方制劑可能有引起肝損傷的風險。我國傳統(tǒng)的中藥減毒方法有兩種，分別為炮制減毒和配伍減毒。本文擬從配伍減毒的角度出發(fā)，在細胞水平上對何首烏配伍減毒情況進行研究。

何首烏作為保健類中藥，在中國歷史上有廣泛的應用，但古人對其導致肝損傷的記載很少。據(jù)本草考證：“首烏以茯苓為使”，古人多強調(diào)首烏與茯苓配伍使用。2013年CFDA提示關注的5個含何首烏的制劑(養(yǎng)血生發(fā)膠囊、首烏丸、首烏片、首烏延壽片、首烏延壽顆粒)皆沒有與茯苓配伍使用。文獻研究發(fā)現(xiàn)，何首烏配伍茯苓的現(xiàn)代研究較少。合適的配伍方法是否有助于降低何首烏的肝毒性，值得我們?nèi)ド钊胙芯?。在臨床上被廣泛使用的解百藥毒、調(diào)和諸藥的甘草與何首烏配伍使用是否有助于緩和何首烏的毒性，也未見報道。另外，近期課題組在研究何首烏的肝毒性時發(fā)現(xiàn)，其能導致肝臟微循環(huán)灌注障礙[1]。活血藥(三七)是否能改善首烏引起的微循環(huán)障礙，達到減毒的作用，也未見相關報道。肝竇內(nèi)皮細胞作為肝臟代謝的屏障，大部分藥物經(jīng)肝臟代謝時會首先受累。為此，本研究以原代肝竇內(nèi)皮細胞為模型，采用高內(nèi)涵分析方法[2]，考察首烏與茯苓、甘草、三七的配伍減毒情況，尋找合適的配伍減毒方法，為臨床何首烏的合理用藥提供參考。

1 試藥和儀器

1.1 試藥

肝竇內(nèi)皮細胞特制基礎培養(yǎng)基(武漢原生原代生物醫(yī)藥科技有限公司，批號：Med-0002)；胎牛血清、胰蛋白酶(Gibco公司)；青霉素；鏈霉素；磷酸鹽緩沖液；96孔板(Costar 3599，康寧公司)；二甲基亞砜(DMSO)；除菌濾器(25 mm，0.22 μm)；細胞培養(yǎng)瓶(430720，康寧公司)；Hochest 33342(H3570，生命科學)；SYTOX?Orange Nucleic Acid Stain(S11368，生命科學)；水為超純水。茯苓、甘草、三七由解放軍第三〇二醫(yī)院中藥房提供；何首烏(北京綠野藥業(yè)有限公司，批號：13101701)經(jīng)解放軍第三〇二醫(yī)院肖小河研究員鑒定為蓼科植物何首烏的干燥塊根。

1.2 儀器

高內(nèi)涵篩選系統(tǒng)(Molecular Devices公司)；TC10TM自動細胞計數(shù)器(Bio-Rad公司)；恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱(NAPCO公司)；常規(guī)倒置顯微鏡(上海澤權儀器設備有限公司)；臺式低速離心機(湖南赫西儀器裝備有限公司)；超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)；回流提取裝置、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司)；ZK-82B 型真空干燥箱(上海市實驗儀器總廠)；AL204微量分析天平(Mettler Toledo公司)；LGJ-18型冷凍干燥機(北京西四環(huán)科學儀器廠)；高壓蒸汽滅菌器(SN510C，重慶雅馬拓科技有限公司)。

2 方法

2.1 樣品制備

首烏制備方法：采用50%乙醇冷浸提取2次，每次24 h，提取溶劑為8倍，過濾，合并濾液，減壓蒸發(fā)濃縮，冷凍干燥得凈膏，出膏率為15.7%[3]。

茯苓制備方法：采用加熱回流，固液比為1∶12，提取次數(shù)為2次，提取時間為100 min，水浴蒸發(fā)濃縮，冷凍干燥得凈膏，出膏率為2.28%[4]。

甘草制備方法：采用加熱回流，加10倍量水，回流提取2次，提取時間分別為1.5、1 h，合并濾液并減壓濃縮，冷凍干燥得凈膏，出膏率為23.58%[5]。

三七制備方法：10倍量水，加熱回流提取2次，提取時間分別為2、1 h，合并濾液并減壓濃縮，冷凍干燥得凈膏，出膏率為37.17%。

2.2 肝竇內(nèi)皮細胞毒性評價方法

正常人肝竇內(nèi)皮細胞購自武漢原生原代生物醫(yī)藥科技有限公司。在含有10%的胎牛血清、100 U·mL-1的青霉素、100 μg·mL-1的鏈霉素的肝竇內(nèi)皮細胞特制基礎培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2條件下進行常規(guī)培養(yǎng)，實驗均在細胞生長對數(shù)期進行。細胞均勻接種在96孔板中，每孔5000個細胞，鋪板24 h后給藥，給藥24 h后進行熒光染色。本實驗采用二重熒光標記法，用質(zhì)量濃度為1 μg·mL-1的Hochest 33342(Ex/Em：350/461 nm)標記所有細胞的細胞核顯藍色；用濃度為1 μmol·L-1的SYTOX?Orange Nucleic Acid Stain(Abs/Em：547/570 nm)標記死細胞的細胞核顯橙色。于37 ℃避光孵育15 min，細胞被標記好后，由高內(nèi)涵儀器直接對細胞進行成像分析。統(tǒng)計結(jié)果，并分析各孔的細胞存活情況。精確稱量何首烏總提物50 mg，溶于DMSO中作為儲液備用。

2.3 統(tǒng)計方法

用ImageXpress Micro XL高內(nèi)涵軟件對圖像進行處理分析，實驗數(shù)據(jù)以GraphPad Prism 5.0、IBM SPSS Statistics 20、OriginPro 8.5軟件處理，所有數(shù)據(jù)采用獨立樣本t檢驗進行統(tǒng)計學處理。P<0.05設為有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1何首烏總提取物對肝竇內(nèi)皮細胞毒性檢測結(jié)果及IC50值

本實驗設6個濃度梯度，3倍稀釋，最高質(zhì)量濃度為2 mg·mL-1(相當于生藥量12.74 mg·mL-1)，用ImageXpress Micro XL高內(nèi)涵儀器，采用二重熒光標記法(Hochest 33342標記所有的細胞，SYTOX?Orange Nucleic Acid Stain標記死細胞)，以每孔活細胞的百分比作為評價指標，用GraphPad Prism 5.0 軟件處理，結(jié)果：LogIC50值為-0.12，計算IC50為0.76 mg·mL-1(相當于生藥量4.84 mg·mL-1)。見圖1。

圖1 何首烏總提取物作用于肝竇內(nèi)皮細胞的IC50值

3.2基于高內(nèi)涵分析評價何首烏與茯苓、甘草、三七的配伍減毒情況

3.2.1首烏與茯苓、甘草、三七的配伍減毒情況高內(nèi)涵成像結(jié)果，見圖2～3。實驗取IC50值作為何首烏的配伍實驗用量，分別配伍不同濃度的茯苓、甘草、三七，復6孔，分別作對照。用ImageXpressMicroXL高內(nèi)涵儀器分析，采用二重熒光標記法(Hochest33342標記所有細胞顯藍色，SYTOX?OrangeNucleicAcidStain標記死細胞顯橙色)，以每孔活細胞的百分比作為評價指標，用OriginPro8.5軟件作圖。

注：A.首烏；B.首烏+茯苓；C.首烏+甘草；D.首烏+三七；茯苓質(zhì)量濃度為2 mg·mL-1；甘草質(zhì)量濃度為4 mg·mL-1；三七質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1。圖2 首烏與茯苓、甘草、三七的配伍減毒高內(nèi)涵成像結(jié)果

圖2顯示，單純何首烏組死細胞數(shù)很多，大約占細胞總數(shù)的45%；首烏+茯苓組的死細胞數(shù)很少，約占3%；首烏+甘草組的死細胞數(shù)較少，約占10%；首烏+三七組的死細胞數(shù)較多，約占20%。從染色結(jié)果來看，首烏配伍茯苓的減毒效果最好。

3.2.2高內(nèi)涵軟件統(tǒng)計分析各孔的活細胞數(shù)及其百分比，綜合評價何首烏與不同濃度的茯苓、甘草、三七在肝竇內(nèi)皮細胞上的配伍減毒情況，見圖3～5。

注：*P<0.05；**P<0.01。下同。圖3 何首烏與不同濃度的茯苓配伍減毒結(jié)果

圖4 首烏與不同濃度的甘草配伍減毒結(jié)果

圖5 首烏與不同濃度的三七配伍減毒結(jié)果

結(jié)合圖3～5可以看出：首烏濃度為4.84mg·mL-1(生藥量)時，對肝竇內(nèi)皮細胞表現(xiàn)出明顯的抑制作用，配伍茯苓提取物質(zhì)量濃度為0.07～2mg·mL-1，合生藥首烏∶茯苓為1∶(1.58～0.055)；配伍甘草提取物質(zhì)量濃度為0.15～4mg·mL-1，合生藥首烏∶甘草為1∶(7.61～0.285)；三七提取物質(zhì)量濃度為0.037～1mg·mL-1，合生藥首烏∶三七為1∶(48.89～1.80)。三者都能明顯地降低何首烏對肝竇內(nèi)皮細胞的毒性作用，且茯苓的減毒效果相對較好。

4 討論

古代本草記載“首烏以茯苓為使”，現(xiàn)在何首烏的使用較少見規(guī)范的配伍減毒應用，而其肝毒性屢見報道，為明確首烏的肝毒性是否與合理的配伍有關，本研究在細胞水平上分別考察了茯苓、甘草、三七與何首烏配伍使用對其肝毒性的影響。結(jié)果顯示三者都能明顯地降低何首烏的肝細胞毒性，且茯苓的效果較好，在一定程度上佐證了古代首烏與茯苓相使為用的科學性。

盡管現(xiàn)在對何首烏的肝毒性報道很多，但我們要對此有客觀全面的認識，從不同角度探索何首烏的毒性問題。前期課題組從炮制減毒的角度探討了何首烏的毒性情況，結(jié)果顯示，合理的炮制方法能在一定程度上降低其肝毒性。本文從配伍減毒的角度探討了首烏的減毒情況，表明在細胞水平上首烏與茯苓、甘草、三七配伍確實能降低其毒性作用。雖然體外細胞實驗不能完全模擬人體的自身代謝，但卻能給臨床上首烏的配伍減毒提供參考。本文沒有在中醫(yī)的理論指導下應用，今后需要緊密結(jié)合臨床，在動物水平上進行更加深入的研究，尋求最好的配伍解毒方法和最佳的配伍比例。

[1] 常青，趙海娟，李春，等.制首烏聯(lián)合定量運動對大鼠肝臟微循環(huán)及肝功能的影響[J].中國藥物警戒，2014，11(4)：193-197.

[2]DragunowM.High-contentanalysisinneuroscience[J].NatRevNeurosci，2008，9(10)：779-788.

[3] 呂旸.基于肝細胞毒價檢測的何首烏質(zhì)量控制方法研究[D].北京：北京化工大學，2013.

[4] 趙子劍.茯苓多糖的提取方法優(yōu)選[J].時珍國醫(yī)國藥，2009，20(9)：2207-2208.

[5] 孫付軍，周倩，王春芳，等.甘草炮制前后藥效學比較[J].中國實驗方劑學雜志，2010，16(14)：115-118.

CompatibilityAttenuatedDetoxificationstudyonRadixPolygoniMultiflori-causedHepaticSinusEndothelialCellInjuryBasedonHighContentAnalysis

PANGJingyao1，2，LIYumeng3，BAIZhaofang2，ZHAOYanLing2，ZHAOKuijun1，MAZhijie1*，WANGJiabo2*，XIAOXiaohe2

(1.BeijingFriendshipHospital，CapitalMedicalUniversity，Beijing100050，China；2.ChinaMilitaryInstituteofChineseMedicine，302MilitaryHospital，Beijing100039，China；3.YunnanUniversityOfTCM，CollegeofTraditionalChineseMedicine，Kunming650500，China)

Objective：To observe the compatibility attenuated detoxification of Radix Polygoni Multiflori-caused hepatic sinus endothelial cell injury，and provide reference for the further study of the clinical rational medication.Methods：The High Content Analysis was applied to detect the compatibility attenuated detoxification of Radix Polygoni Multiflori-caused hepatic sinus endothelial cell injury with Poria cocos，Radix Glycyrrhizae and Radix notoginseng.Result：A dose dependent relation existed between Radix Polygoni Multiflori and hepatic sinus endothelial cells injury，which was embedded significantly in compatibility attenuated detoxification with different concentration of Poria cocos，Radix Glycyrrhizae and Radix notoginsen under the dose of IC50.Compatibility attenuated detoxification with Poria cocos effected better，of which with Radix notoginseng was the least potent.Conclusion：Compatibility attenuated detoxification effect of Radix Polygoni Multiflori and Poria cocos，Radix Glycyrrhizae and Radix notoginsen was specifically reflected through High Content Analysis，which may provide a scientific basis for the safety and rationality of clinical medication.

Radix Polygoni Multiflori；compatibility attenuated detoxification；hepatic sinus endothelial cells；High Content Analysis

2014-11-30)

國家重大新藥創(chuàng)制專項課題(2015ZX09501-004-001-008)；國家公益性行業(yè)專項課題(201507004-04)；國家自然科學基金項目(81373984，81403126)

*

王伽伯，博士，助理研究員，研究方向：中藥藥性與毒性評價；Tel：(010)66933325，E-mail：pharm_sci@126.com 馬致潔，博士，藥師，研究方向：中藥藥理與毒理研究；E-mail：13811647091@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.4.008