潘雪豐

(福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)系，福建 福州 350101)

鐵皮石斛(Dendrobium candidum Wall.ex Lindll)，屬蘭科(Orchidaceae)石斛屬(Dendrobbium)多年生附生型草本植物，主要分布于安徽、浙江、福建等地。鐵皮石斛是我國的名貴中藥，其味甘、性微寒，具有益胃生津、滋陰清熱、提高免疫力、抗腫瘤、延緩衰老等功效[1]。鐵皮石斛藥用部分是新鮮或干燥的莖，多糖是最主要的有效成分[2]，石斛生理活性的強(qiáng)弱與其多糖含量有一定關(guān)系，常以其多糖含量高低來判斷石斛類藥材質(zhì)量的好壞。

目前鐵皮石斛多糖提取方法主要有水提醇沉法、超聲波提取法和酶提法等3種。傳統(tǒng)的水提醇沉法步驟繁多，提取率不高[3];超聲波提取技術(shù)通過機(jī)械、熱學(xué)及空化等作用，可提高提取率[4];酶提法利用酶水解細(xì)胞壁，使細(xì)胞中含有的物質(zhì)充分溶解到水中，提取率大幅提高，是近年來應(yīng)用比較廣泛的提取技術(shù)[5]。鐵皮石斛的藥理作用主要成分是多糖，為此，藥理學(xué)研究上通常要盡量脫除蛋白質(zhì)。Sevage法是經(jīng)典的脫蛋白法，除蛋白較溫和，可以多次使用，但同時(shí)會(huì)損失部分多糖成分。本研究探討不同次數(shù)Sevage法對(duì)鐵皮石斛脫蛋白率和多糖損失率的影響，以提高多糖提取率和純度，為進(jìn)一步研究鐵皮石斛多糖的藥理作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鐵皮石斛新鮮莖稈購自康恩貝集團(tuán)浙江濟(jì)公緣藥業(yè)有限公司。無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品由中國藥品生物制品檢定所提供(批號(hào):110833－201205)，牛血清白蛋白V標(biāo)準(zhǔn)品購自上海源葉生物科技有限公司(批號(hào):ZN0521LA15)，其他試劑均為分析純，水為實(shí)驗(yàn)用的純凈水。主要儀器設(shè)備包括TDL-5A離心機(jī)(上海菲恰爾儀器分析有限公司)和T6新世紀(jì)722型可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)。

1.2 多糖提取與測(cè)定

1.2.1 提取 將新鮮鐵皮石斛莖稈剪成3 mm長小段，殺青烘干至恒重，隨后粉碎備用。稱取1 g石斛粉末用濾紙包裹，加150 mL石油醚，用索氏提取器80℃回流提取1.5 h，脫去石斛中的脂肪。烘干后的藥包加80%乙醇溶液150 mL，用索氏提取器95℃回流提取1.5 h，脫去石斛中的醇溶性單糖[6]。參考唐政等[5]及王培培等[7]方法并略加修改。將烘干的藥包放置于圓底燒瓶內(nèi)，加入純凈水100 mL和1 g混合酶(0.5 g纖維素酶和0.5 g果膠酶)，50℃下回流提取135 min后，抽濾，濾液另存;濾渣加入40 mL蒸餾水70℃回流提取120 min，此步驟重復(fù)2次;合并3次濾液，將多糖提取液90℃滅活水解酶活性15 min后，離心取上清液。

1.2.2 含量測(cè)定 準(zhǔn)確稱取100 mg葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品加入100 mL蒸餾水，振蕩搖勻。用蒸餾水分別稀釋為100、200、300、400、500 μg·mL－1，各取2 mL 分別置于5 個(gè)干燥的試管中，以2 mL 蒸餾水為空白對(duì)照。在冰浴中加入新鮮配制的硫酸蒽酮試劑6.0 mL，搖勻，置沸水浴中加熱15 min，取出，冰浴冷卻15 min，靜置后測(cè)定D625nm，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以稀釋40倍后的石斛多糖提取溶液1 mL為供試溶液，采用蒽酮比色法測(cè)定含量。

多糖提取率/%=(D625nm－0.027 1)/0.002×n×v×100式中，n為提取液稀釋的倍數(shù)，v為提取液體積/mL。

1.3 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

稱取100 mg考馬斯亮藍(lán)G-250溶于50 mL 90%乙醇中，加入85%磷酸100 mL，最后用純凈水定容至1 000 mL。準(zhǔn)確稱取100 mg牛血清白蛋白，溶于100 mL蒸餾水中，即為1 000 μg·mL－1原液。用純凈水將原液分別稀釋為20、40、60、80、100 μg·mL－1。各取1 mL，分別置于5 個(gè)干燥的試管中，以1 mL 蒸餾水為對(duì)照。每個(gè)試管加入考馬斯亮藍(lán)G-250試劑5 mL。渦流混合，放置10 min，測(cè)定D595nm，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。未稀釋的石斛多糖提取溶液為供試品溶液，采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定含量。

蛋白含量 =(D595nm－0.007 1)/0.006 2×v式中，v為提取液體積/mL。

1.4 Sevage法脫除蛋白方法

參考穆文靜等[8]Sevage法脫蛋白工藝。Sevage試劑(正丁醇∶氯仿為1∶4)與多糖提取液比例為1∶2，振蕩20 min，在3 000 r·min－1下離心3 min，取上清液，即得精制多糖溶液。測(cè)定不同次數(shù)Sevage法脫蛋白對(duì)鐵皮石斛蛋白和多糖的影響，以確定最佳脫蛋白次數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

方差分析模型采用單因素有重復(fù)觀察值，平均值多重比較采用SNK(Student-Newman-Keuls)測(cè)驗(yàn)。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SAS 8.1數(shù)理統(tǒng)計(jì)軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖含量分析

繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程:y=0.002x+0.027 1，R2=0.997 6。由此計(jì)算鐵皮石斛多糖為383.7 mg·g－1，提取率為38.4%。該結(jié)果與文獻(xiàn)[5]報(bào)道結(jié)果相接近。

2.2 蛋白含量分析

鐵皮石斛含有蛋白質(zhì)。根據(jù)考馬斯亮藍(lán)G-250繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)，得線性回歸方程:y=0.006 2x+0.007 1，R2=0.999 3。由此計(jì)算鐵皮石斛可溶性蛋白質(zhì)含量為 17.82 mg·g－1，占 1.78%。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose at D625 nm

圖2 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of bovine serum albumin at D625 nm

2.3 Sevage法脫蛋白次數(shù)對(duì)蛋白和多糖含量的影響

2.3.1 蛋白含量 從表1可見，Sevage法脫除鐵皮石斛蛋白效果較明顯，3次脫蛋白率分別為21.9%、29.9%、32.0%。多重比較表明，第1次脫蛋白率與第2、第3次脫蛋白率有顯著差異(P＜0.05)，脫蛋白率絕對(duì)值相差達(dá)8.0% －10.1%;第2與第3次脫蛋白率未見顯著差異(P＞0.05)。

表1 Sevage法脫蛋白次數(shù)對(duì)脫蛋白率和多糖損失率的影響1)Table1 Effects of number of deproteinization sevage treatments on protein removal and polysaccharide loss from sugar extracts

2.3.2 多糖含量 從表1可見，不同次數(shù)Sevage法脫蛋白后多糖損失率明顯增加。3次脫蛋白后多糖損失率分別為28.3%、56.6%、62.1%。多重比較表明，第1次脫蛋白時(shí)多糖損失率與第2、第3次多糖損失率有顯著差異(P＜0.05)，多糖損失率絕對(duì)值相差達(dá)28.3% －33.8%;第2與第3次脫蛋白后多糖損失率未見顯著差異(P＞0.05)。

3 小結(jié)

脫蛋白是多糖純化的重要步驟。為獲得較高的脫蛋白率和糖保留率，并且保持多糖較高的生物活性，選擇合適的脫蛋白方法顯得尤為關(guān)建。Sevage法是經(jīng)典的脫蛋白法，具有操作簡便、試劑廉價(jià)等優(yōu)點(diǎn)，除蛋白較溫和，可以多次使用，但同時(shí)會(huì)損失部分多糖成分。本研究探討了不同次數(shù)Sevage法對(duì)鐵皮石斛脫蛋白率和多糖損失率的影響，發(fā)現(xiàn)脫蛋白2次或2次以上，脫蛋白率提高不明顯且多糖損失嚴(yán)重。為此，建議Sevage法脫蛋白以1次為宜，多糖提取率可達(dá)27.5%。本文采用酶解法結(jié)合Sevage法脫蛋白等工藝提取鐵皮石斛多糖，具有較高的提取率和純度，且工藝穩(wěn)定、重復(fù)性好。

[1]徐步青，崔永一，郭岑，等.不同光照強(qiáng)度和培養(yǎng)時(shí)間下鐵皮石斛類原球莖生物量、多糖和生物堿量的動(dòng)態(tài)變化[J].中草藥，2012，43(2):355 －359.

[2]陳超琴，蔣麗華，趙黎明，等.石斛多糖的研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技，2012，33(2):441－445.

[3]周術(shù)濤，雷志力，俞巧仙，等.均勻設(shè)計(jì)與正交設(shè)計(jì)聯(lián)用優(yōu)選鐵皮石斛多糖提取工藝的研究[J].食品工業(yè)科技，2010，31(11):296 －297，314.

[4]葉余原.超聲法提取鐵皮石斛多糖工藝的研究[J].中藥材，2009，32(4):617－620.

[5]唐政，陳小香，黃獻(xiàn)珠.混合酶提法提取鐵皮石斛中石斛多糖的優(yōu)化工藝研究[J].北方園藝，2014(6):132－134.

[6]熊麗萍，萬屏南，衷友泉.幾種石斛多糖的提取分離及其抗氧化性能研究[J].江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，18(4):55－56.

[7]王培培，魯芹飛，陳建南，等.正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化鐵皮石斛多糖的提取工藝[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2012，23(11):2781－2782.

[8]穆文靜，杜玲，扈瑞平，等.鈍頂螺旋藻多糖Sevage法脫蛋白工藝的研究[J].內(nèi)蒙古石油化工，2011，37(10):1－4.