王曉國(guó)，周主貴，李冬萍，李秀玲，張金蓮，陳廷速

(1.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所;2.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所，廣西 南寧 530007)

兜蘭屬(Paphiopedilum)植物是最受歡迎的蘭科植物之一，具有極高的觀賞價(jià)值[1]。隨著國(guó)際花卉市場(chǎng)對(duì)兜蘭的大量需求，以及持續(xù)的采集壓力致使我國(guó)野生兜蘭種群數(shù)目銳減，部分兜蘭在野外已極難發(fā)現(xiàn)[2]?；謴?fù)兜蘭種群數(shù)量是保護(hù)兜蘭的有效途徑之一[3－4]，然而蘭科植物微小的種子本身無(wú)法貯存養(yǎng)分。在自然條件下其種子萌發(fā)階段完全依靠菌根真菌為其提供養(yǎng)分[5]，但人工種植過(guò)程中缺少蘭科真菌的作用，制約了蘭科植物種群恢復(fù)的進(jìn)程[6]。研究表明，菌根對(duì)多種植物的生長(zhǎng)發(fā)育有促進(jìn)作用，蘭科植物也與特定的菌根真菌相結(jié)合而汲取養(yǎng)分[7－9]。自然條件下，蘭科菌根真菌促進(jìn)種子萌發(fā)，有助于植株吸收無(wú)機(jī)養(yǎng)分和水分[10]。因此，菌根真菌對(duì)蘭科植物生長(zhǎng)發(fā)育極為重要，在蘭科植物人工栽培中引入菌根化育苗技術(shù)具有廣闊的應(yīng)用前景。

蘭科菌根真菌的形態(tài)學(xué)特征與鑒定、共生關(guān)系的研究均涉及到菌根結(jié)構(gòu)觀察與侵染率測(cè)定。由于研究者所采用的染色方法不同[11－13]，其研究結(jié)果往往缺乏可比性。因此，有必要對(duì)現(xiàn)有的蘭科菌根染色方法進(jìn)行比較和改良。本研究以同色兜蘭營(yíng)養(yǎng)根為材料，對(duì)比酸性品紅、臺(tái)酚藍(lán)、蘇丹紅Ⅳ、苯胺藍(lán)和墨水等5種染色劑對(duì)其菌根真菌的染色效果，以期建立高效、準(zhǔn)確的同色兜蘭菌根染色方法，為兜蘭菌根研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

同色兜蘭植株采集于廣西雅長(zhǎng)蘭科植物自然保護(hù)區(qū)，現(xiàn)保存于廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所蘭科植物資源圃中。選擇資源圃中健康植株的營(yíng)養(yǎng)根作為試驗(yàn)材料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 脫色時(shí)間 采集同色兜蘭生長(zhǎng)良好的營(yíng)養(yǎng)根，用已消毒的剪刀截取4－5 cm的根3－4段。在自來(lái)水下沖洗干凈，切成2－3 cm的小段，用濾紙吸干水，加0.2 g·mL－1KOH溶液完全浸泡根系，90℃分別水浴3、5、7、9 h，然后用自來(lái)水輕輕沖洗3次。用10%H2O2脫色5 h后用自來(lái)水沖洗3次。加2%HCl溶液室溫酸化30 min，去掉HCl溶液，用自來(lái)水輕輕沖洗3次。用5% 醋酸墨水染色，即以5 mL派克純黑書寫墨水加95 mL家用白醋配制。染色液室溫過(guò)夜后，將根段放在水中保存。

1.2.2 5種染色方法對(duì)比 用5種染色劑進(jìn)行染色處理，各染色劑配制如下。①苯胺藍(lán)染色液:0.1 g苯胺藍(lán)+100 mL 95%酒精;②酸性品紅染色液:0.15 g酸性品紅+100 mL乳酸+100 mL甘油+100 mL蒸餾水;③蘇丹紅Ⅳ染色液:0.1 g+蘇丹紅Ⅳ染料+10 mL 95%酒精+10 mL甘油;④臺(tái)酚藍(lán)染色液:0.05 g臺(tái)酚藍(lán)+100 mL乳酸+100 mL甘油+100 mL蒸餾水;⑤醋酸墨水染色液:5 mL派克(Quink)純黑書寫墨水+95 mL家用白醋。各處理均采用1.2.1所述方法，但90℃水浴5 h;①－④染色后的根段在乳酸甘油溶液(乳酸∶甘油∶蒸餾水為1∶2∶1)中保存，⑤染色后的根段在蒸餾水中保存。

1.2.3 制片與顯微鏡觀察 挑取脫色處理后的根段于載玻片上，加2－3滴乳酸于根系使其起褪色作用，蓋上24 mm×50 mm蓋玻片，用手指將根段稍用力壓扁。使用奧林巴斯CX41顯微鏡觀察和拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫色時(shí)間對(duì)同色兜蘭菌根染色效果的影響

同色兜蘭菌根不同脫色時(shí)間下染色效果差異較大(圖1)。從圖1可見(jiàn)，3 h處理的菌根皮層雜質(zhì)未消煮干凈，造成皮層染色較深，反差不明顯;7 h處理的菌根皮層雜質(zhì)少，但部分皮層細(xì)胞破裂，染色背景雜;9 h處理的菌根皮層多數(shù)已經(jīng)消煮爛，皮層細(xì)胞破裂較多，細(xì)胞內(nèi)容物染色，不易進(jìn)行壓片觀察;5 h處理的菌根皮層比較干凈，雜質(zhì)少，染色效果較好。

圖1 不同脫色時(shí)間下同色兜蘭菌根皮層染色效果(×10)Fig.1 Dye results of P.concolor mycorrhiza in different treatment durations

2.2 同色兜蘭菌根5種染色效果對(duì)比

2.2.1 同色兜蘭菌根 同色兜蘭菌根5種染色效果見(jiàn)圖2。其中，酸性品紅和蘇丹紅Ⅳ染色方法操作簡(jiǎn)便，但是兜蘭菌根真菌很難上色，僅見(jiàn)根皮層被染上相同或略淺的顏色，極少見(jiàn)菌絲著色;苯胺藍(lán)染色效果一般，根內(nèi)雜質(zhì)被染上較深的顏色;臺(tái)酚藍(lán)染色效果可靠穩(wěn)定，但皮層被染上相同或略淺的顏色，菌根真菌與皮層組織之間顏色反差小;墨水染色對(duì)菌根真菌的染色效果較好，能清楚地觀察到菌根真菌的泡囊和菌絲著色牢固。

圖2 同色兜蘭菌根5種染色效果對(duì)比及菌根真菌形態(tài)Fig.2 Comparison among five staining results in P.concolor mycorrhiza and mycorrhizal fungi morphology

2.2.2 蘭科真菌及其他菌根真菌 蘭科真菌是蘭科植物特有的一類菌根真菌，其在蘭科植物根內(nèi)具有明顯的菌絲圈、菌絲團(tuán)、菌絲結(jié)及菌絲消解的針狀結(jié)晶等結(jié)構(gòu)。墨水染色方法可以清晰地觀察到蘭科真菌不同時(shí)期的形態(tài)，也能夠較好地染色觀察到其他菌根真菌的菌絲和泡囊(圖3)。此方法適用于同色兜蘭菌根真菌鑒別和侵染率統(tǒng)計(jì)。其他4種染色方法對(duì)蘭科真菌的染色效果不理想，對(duì)其他菌根真菌的染色效果也達(dá)不到觀察目的。由此可見(jiàn)，醋酸墨水染色方法可以較好地區(qū)分蘭科真菌和其他菌根真菌。

2.2.3 效果及成本比較 對(duì)比5種染色方法的染色效果、成本、試劑毒性和根段保存時(shí)間(表1)，墨水染色具有無(wú)毒、成本低、清晰度高、反差大和染色效果佳的特點(diǎn)。菌根染色后能夠較好地觀察不同菌根真菌形態(tài)，便于對(duì)蘭科菌根真菌鑒別和侵染率的統(tǒng)計(jì)。

表1 5種菌根染色方法染色效果比較Table1 Comparison among five results of staining in P.concolor mycorrhiza

3 結(jié)論

以蘭科真菌為目標(biāo)進(jìn)行染色時(shí)，會(huì)有其他種類真菌同時(shí)被染色，這些真菌是非蘭科真菌的內(nèi)生真菌，與蘭科真菌形態(tài)差異較大，極易區(qū)分，利用醋酸墨水染色方法可以對(duì)兜蘭其他內(nèi)生真菌進(jìn)行觀察(圖2)。酸性品紅染色時(shí)，皮層被染上淡淡的紅色，菌絲不能著色;用蘇丹紅Ⅳ染色時(shí)，僅皮層的雜質(zhì)著色，看不見(jiàn)菌絲著色;而用苯胺藍(lán)染色時(shí)，一般的雜質(zhì)也能染上較深的顏色，無(wú)菌絲著色;用臺(tái)酚藍(lán)染色時(shí)，泡囊、菌絲都能著色，有部分雜質(zhì)也著色，根皮層也染上略淺的顏色，反差不明顯、不易觀察;采用醋酸黑色墨水染色時(shí)，菌絲著色十分牢固，經(jīng)過(guò)清水長(zhǎng)時(shí)間浸泡脫色后，根皮層組織可以接近完全脫色，然而真菌的菌絲仍然保持鮮明的藍(lán)色，可以通過(guò)形態(tài)特征的比較，區(qū)分蘭科真菌與其他根外真菌。與此相比，酸性品紅和蘇丹紅Ⅳ染色后，皮層組織與真菌在脫色階段是同步脫色的，當(dāng)皮層組織脫色至無(wú)色透明時(shí)，真菌菌絲的形態(tài)亦不再可辨。通過(guò)比較可知，經(jīng)過(guò)墨水染色的根系，根內(nèi)的菌絲等結(jié)構(gòu)著色很深，與背景反差大，而且其他各種結(jié)構(gòu)表現(xiàn)都比其他幾種染色劑染色效果好。

本研究表明，醋酸墨水染色法對(duì)區(qū)分蘭科真菌與其他共生真菌更有效，在觀察菌絲的形態(tài)、入侵方式和統(tǒng)計(jì)侵染率時(shí)，可以減少誤差。在醋酸墨水染色法中使用Quink黑色墨水為染色劑，既兼顧染色效果又低毒性。

[1]郎楷永，陳心啟，羅毅波，等.中國(guó)植物志·兜蘭屬:第17卷[M].北京:科學(xué)出版社，1999.

[2]羅毅波，賈建生，王春玲.初論中國(guó)兜蘭屬植物的保護(hù)策略及其潛在資源優(yōu)勢(shì)[J].生物多樣性，2003，11(6):491－498.

[3]HOSSAIN M M，KANT R，VAN P T，et al.The application of biotechnology to orchids[J].Critical Reviews in Plant Sciences，2013，32(2):69 －139.

[4]ARDITTI J.Factors affecting the germination of orchid seeds[J].The Botanical Review，1967，33(1):1 －97.

[5]陳瑞蕊，林先貴，施亞琴.蘭科菌根的研究進(jìn)展[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2003，9(1):97－101.

[6]DEARNALEY J D W.Further advances in orchid mycorrhizal research[J].Mycorrhiza，2007，17(6):475 －486.

[7]鄭超文，肖婭萍.蘭科菌根真菌研究方法的概述[J].微生物學(xué)雜志，2014，34(4):85－89.

[8]劉潤(rùn)進(jìn)，李曉林.叢枝菌根及其應(yīng)用[M].北京:科學(xué)出版社，2000.

[9]范黎，郭順星，徐錦堂.我國(guó)部分蘭科植物菌根的內(nèi)生真菌種類研究[J].山西大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，1998，21(2):169－177.

[10]ZENG S J，ZHANG Y，DA SILVA J A T，et al.Seed biology and in vitro seed germination of Cypripedium[J].Critical Reviews in Biotechnology，2014，34(4):358 －371.

[11]呂梅，伍建榕，馬煥成.春蘭菌根的顯微結(jié)構(gòu)觀察[J].西南林學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，25(2):8－11.

[12]陳廷速，李松，張金蓮，等.叢枝菌根(AM)真菌對(duì)甘蔗根系侵染研究[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，24(5):1757－1760.

[13]楊亞寧，巴雷，白曉楠，等.一種改進(jìn)的叢枝菌根染色方法[J].生態(tài)學(xué)報(bào)，2010，30(3):774－779.