邸萬山（遼寧石化職業(yè)技術(shù)學(xué)院應(yīng)用化學(xué)系，遼寧錦州121001）

高效液相色譜內(nèi)標(biāo)法測定醬油中糖精鈉和苯甲酸鈉

邸萬山
（遼寧石化職業(yè)技術(shù)學(xué)院應(yīng)用化學(xué)系，遼寧錦州121001）

以山梨酸鉀為內(nèi)標(biāo)物，采用高效液相色譜法測定醬淮中的糖精鈉和苯甲酸鈉的含量。樣品經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液提取后，采用Nova-Pak C18色譜柱（3.9 mm×15 mm×5 μm）分離，以甲醇-0.02 mol/L乙酸銨（5∶95，V/V）為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，流速1 mL/min，紫外檢測波長230 nm。結(jié)果表明，在0.1～1.4 mg/kg的添加范圍，糖精鈉、苯甲酸鈉的加標(biāo)回收率分別為99.5%～102.3%，95.1%～102.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為0.69%和0.82%。所測醬淮中糖精鈉和苯甲酸鈉的含量分別為3.27 mg/kg和0.133 mg/kg。采用該方法回收率高、準(zhǔn)確性好，可用于醬淮中糖精鈉和苯甲酸鈉含量分析。

高效液相色譜法；醬淮；糖精鈉；苯甲酸鈉；檢測

隨著生活水平的提高，食品的種類也日益豐富，為了提高食品的保藏性能，延長保質(zhì)期，改善食品的感官性狀，在食品中加入適量的防腐劑、甜味劑、發(fā)色劑、人工合成色素等添加劑來改變食品的色、香、味、形等特征。但是，食品添加劑加入量若超過了國家標(biāo)準(zhǔn)允許的最大使用量，就會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生危害［1］。我國對(duì)糖精鈉、苯甲酸鈉的最大使用量的規(guī)定分別為5 mg/kg和0.15 g/kg［2］。

醬淮俗稱豉淮，是我國傳統(tǒng)的釀造食品，富含多肽、氨基酸等營養(yǎng)成分，對(duì)人體鐵吸收有促進(jìn)作用［3］。主要以大豆、小麥、麩皮、食鹽等為原料，在米曲霉分泌酶系的協(xié)同作用下，經(jīng)過制曲、發(fā)酵等程序釀制而成的液體調(diào)味品。醬淮除食鹽成分外，還包括多種氨基酸、可溶性蛋白質(zhì)、還原糖類、有機(jī)酸、色素及香料等成分［4-5］。它能改善菜肴的味道，增添菜肴的色澤；除此之外，醬淮中還含有鈣、鐵等營養(yǎng)元素，能有效維持機(jī)體的生理平衡。因此，醬淮不但具有良好的風(fēng)味和滋味，而且營養(yǎng)豐富，是人們烹飪的重要傳統(tǒng)調(diào)味品［6］。目前，對(duì)醬淮的研究主要集中在醬淮釀造工藝的改進(jìn)［7］、有效成分分析［8-9］等方面，而有關(guān)用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）內(nèi)標(biāo)法測定醬淮中糖精鈉、苯甲酸鈉含量分析的報(bào)道較少。

目前國內(nèi)外對(duì)糖精鈉、苯甲酸鈉含量檢測的方法主要有紫外分光光度法、液相色譜外標(biāo)法等方法。其中高效液相色譜內(nèi)標(biāo)法具有檢出限低、動(dòng)態(tài)線性范圍寬、精密度高、準(zhǔn)確度高、基體效應(yīng)小、分析速度快、可同時(shí)測定多種共存組分等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于食品成分分析［10-12］。本研究目的在于建立內(nèi)標(biāo)法測定醬淮中的糖精鈉、苯甲酸鈉。樣品經(jīng)乙醇溶液提取后，采用Nova-Pak C18（3.9 mm×15 mm× 5 μm）色譜柱分離，以甲醇-乙酸銨為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，紫外檢測波長230 nm。本實(shí)驗(yàn)以山梨酸鉀為內(nèi)標(biāo)物對(duì)醬淮中的糖精鈉、苯甲酸鈉進(jìn)行了測定，為醬淮的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

醬淮樣品：市售；甲醇、乙酸銨均為色譜純（純度≥99.7%）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；糖精鈉、苯甲酸鈉、山梨酸鉀、乙醇、鹽酸均為分析純：天津市化學(xué)試劑三廠。

1.2儀器與設(shè)備

810型高效液相色譜儀：美國Waters公司；KQ-700DB數(shù)控超聲波清洗機(jī)：昆山市超聲儀器有限公司；Milli-Q超純水系統(tǒng)：美國Millipore公司；AUW120D電子分析天平：日本島津公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1色譜條件

色譜柱：Nova-PakC18（3.9mm×15mm×5 μm）；流動(dòng)相：甲醇/0.02 mol/L乙酸銨（5∶95，V/V）；流速：1 mL/min；檢測波長：λ=230 nm；靈敏度：0.2 AUFS；柱溫：25℃；進(jìn)樣體積：10 μL。

1.3.2溶液的制備

0.02 mol/L乙酸銨溶液的配制：稱取1.54 g乙酸銨，加1 000 mL水溶解。

1.000 0 mg/mL山梨酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取0.100 0 g山梨酸鉀，加入適量水溶解，置于100 mL容量瓶中，加水定容、搖勻。

1.000 0 mg/mL糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取0.1000g烘干4h后的糖精鈉，加入適量水溶解，置于100mL容量瓶中，加水定容、搖勻。

1.000 0 mg/mL苯甲酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取0.100 0 g苯甲酸鈉，加1 mL 20 g/L碳酸氫鈉溶液，加入適量水溶解，置于100 mL容量瓶中，加水定容、搖勻。

1.000 0 mg/mL糖精鈉-苯甲酸鈉-山梨酸鉀混合標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液的配制：準(zhǔn)確稱取糖精鈉、苯甲酸鈉、山梨酸鉀各0.100 0 g，加入適量水溶解，置于100 mL容量瓶中，加水定容、搖勻。

0.1000 0 mg/mL糖精鈉-苯甲酸鈉-山梨酸鉀混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液的配制：準(zhǔn)確移取糖精鈉-苯甲酸鈉-山梨酸鉀混合標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液10.00 mL，置于100 mL容量瓶中，加水定容、搖勻。

1.3.3試樣的預(yù)處理

稱取醬淮樣品10.232 5 g于100 mL容量瓶中，加入0.5 mL鹽酸（1∶1）酸化后，加入25 mL體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液，超聲提取25 min，然后加入0.001 0 mg山梨酸鉀，用體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液定容至刻度，搖勻。用0.45 μm濾膜過濾，作為供試液。

1.3.4定性分析

分別取糖精鈉、苯甲酸鈉、山梨酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液及試樣處理液10 μL在相同的色譜條件下分別注入高效液相色譜儀進(jìn)行檢測，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜峰的保留時(shí)間為依據(jù)對(duì)供試液中的成分進(jìn)行定性分析。

1.3.5糖精鈉、苯甲酸鈉對(duì)內(nèi)標(biāo)物山梨酸鉀的相對(duì)響應(yīng)值

取糖精鈉-苯甲酸鈉-山梨酸鉀混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液10 μL注入高效液相色譜儀進(jìn)行分析，得到糖精鈉、苯甲酸鈉、山梨酸鉀的峰面積，分別計(jì)算其與山梨酸鉀相應(yīng)對(duì)響應(yīng)值。

苯甲酸鈉與山梨酸鉀的相對(duì)響應(yīng)值計(jì)算公式如下：

式中：Sa1表示苯甲酸鈉與山梨酸鉀的相對(duì)響應(yīng)值；Aa1、As分別為混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液中苯甲酸鈉、山梨酸鉀的峰面積；Wa1、Ws分別為混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液中苯甲酸鈉、山梨酸鉀的質(zhì)量，g。

糖精鈉與山梨酸鉀的相對(duì)響應(yīng)值計(jì)算公式如下：式中：Sa2表示糖精鈉與山梨酸鉀的相對(duì)響應(yīng)值；Aa2、As分別為混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液中苯甲酸、山梨酸鉀的峰面積；Wa2、Ws分別為混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液中苯甲酸、山梨酸的質(zhì)量，g。

1.3.6定量分析

取試樣處理液10 μL，注入高效液相色譜儀進(jìn)行分析，得到糖精鈉、苯甲酸鈉、山梨酸鉀的峰面積，根據(jù)相對(duì)響應(yīng)值計(jì)算試樣中糖精鈉和苯甲酸鈉的質(zhì)量。試樣中苯甲酸鈉、糖精鈉含量的計(jì)算公式如下：

式中：W樣苯表示試樣中苯甲酸鈉的質(zhì)量，g；W樣山表示試樣中山梨酸鉀的質(zhì)量，g；W樣糖表示試樣中糖精鈉的質(zhì)量，g；W樣表示試樣的質(zhì)量；A樣苯表示試樣中苯甲酸鈉的峰面積；A樣山表示試樣中山梨酸鉀的峰面積；A樣糖表示試樣中糖精鈉的峰面積。

2　結(jié)果與分析

2.1檢測波長的確定

根據(jù)參考文獻(xiàn)［13］，糖精鈉、苯甲酸鈉、山梨酸鉀分別在波長204 nm、224 nm、254 nm處有較大紫外吸收，在此基礎(chǔ)上，在波長200～400 nm進(jìn)行紫外光譜掃描，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，糖精鈉、苯甲酸鈉、山梨酸鉀最大吸收波長分別為228 nm、230 nm、233 nm，3種物質(zhì)在波長230 nm處都有明顯吸收。因此，選擇230 nm作為檢測波長。

圖1　糖精鈉、苯甲酸鈉、山梨酸鉀紫外吸收光譜Fig.1 Ultraviolet absorption spectrum of saccharin sodium，sodium benzoate and potassium sorbate

2.2內(nèi)標(biāo)物的選擇

選擇山梨酸鉀作為內(nèi)標(biāo)物符合以下3點(diǎn)的要求：一是醬淮試樣中不應(yīng)含有內(nèi)標(biāo)物山梨酸鉀；二是山梨酸鉀的保留值應(yīng)該介于與糖精鈉、苯甲酸鈉之間，又能滿足分離度＞1.5；三是山梨酸鉀的加入量與糖精鈉、苯甲酸鈉的峰面積匹配性＞75%［14］。山梨酸鉀的保留時(shí)間介于苯甲酸鈉和糖精鈉之間，并且3者能夠完全分離，滿足作內(nèi)標(biāo)物的要求。

2.3標(biāo)準(zhǔn)品及樣品HPLC色譜圖

采用高效液相色譜法對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液及待測樣品按照色譜工作條件的要求進(jìn)行檢測，所得到的色譜圖見圖2所示。

圖2　混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（A）和待測樣品（B）色譜圖Fig.2 Chromatogram of mixed standard solution（A）and sample（B）

由圖2可知，待測樣品（B）色譜圖中出現(xiàn)苯甲酸鈉、糖精鈉2個(gè)色譜峰，說明樣品中不含有山梨酸鉀。而混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（A）色譜圖中出現(xiàn)苯甲酸鈉、山梨酸鉀、糖精鈉3個(gè)色譜峰，并且分離效果良好。因此，山梨酸鉀可以作為測定苯甲酸鈉、糖精鈉的內(nèi)標(biāo)物。

2.4精密度的測定

取糖精鈉、苯甲酸鈉標(biāo)樣，平行進(jìn)樣5次，檢測到糖精鈉標(biāo)樣的相對(duì)響應(yīng)值分別為1.105、1.092、1.098、1.095、1.097，平均值為1.097；苯甲酸鈉標(biāo)樣的相對(duì)響應(yīng)值分別為1.216、1.209、1.212、1.210、1.199，平均值為1.209。計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），RSD值分別為0.69%和0.82%。結(jié)果顯示該方法的精密度高，能滿足醬淮中糖精鈉和苯甲酸鈉的分析要求。

2.5方法的回收率試驗(yàn)

在已知含量的試樣中分別加入不同質(zhì)量濃度的的糖精鈉、苯甲酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行回收率試驗(yàn)，結(jié)果見表1。

表1　醬淮中糖精鈉和苯甲酸鈉加標(biāo)回收率Table 1 Recovery rates of saccharin sodium and sodium benzoate in soy sauce

由表1可知，糖精鈉、苯甲酸鈉的加標(biāo)回收率結(jié)果分別為99.5%～102.3%，95.1%～102.1%。結(jié)果表明，該方法的準(zhǔn)確度較好。

2.6樣品的檢測

表2　醬淮中糖精鈉和苯甲酸鈉的含量Table 2 Contents of saccharin sodium and sodium benzoate in soy sauce

對(duì)醬淮供試液進(jìn)行檢測，計(jì)算其糖精鈉和苯甲酸鈉的含量，結(jié)果見表2。由表2可知，待測醬淮中糖精鈉和苯甲酸鈉的含量分別為3.27 mg/g和0.133 mg/kg。

3　結(jié)論

以山梨酸鉀為內(nèi)標(biāo)物，建立了一種高效液相色譜內(nèi)標(biāo)法測定醬淮中糖精鈉和苯甲酸鈉的方法。該方法與外標(biāo)法［15-16］比較避免了由于進(jìn)樣體積、檢測器靈敏度、流速以及流動(dòng)相組成發(fā)生變化對(duì)測定結(jié)果的影響。具有回收率高、準(zhǔn)確度高，并且前處理簡單，操作時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，適用于醬淮等常見調(diào)味品中糖精鈉、苯甲酸鈉含量的測定。也同樣適用于其他含有糖精鈉和苯甲酸鈉樣品的測定，應(yīng)用前景廣泛。

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Determination of saccharin sodium and sodium benzoate in soy sauce by HPLC internal standard method

DI Wanshan
（Department of Applied Chemistry，Liaoning Petrochemical Vocational and Technical College，Jinzhou 121001，China）

With potassium sorbate as internal standard，the content of saccharin sodium and sodium benzoate in soy sauce was determined by HPLC. Samples were extracted by 50%ethanol solution，separated by Nova-Pak C18column（3.9 mm×15 mm×5 μm），eluted by methanol-0.02 mol/L ammonium acetate（5∶95，v/v）as mobile phase，with flow rate of 1 ml/min，UV detection wavelength of 230 nm.Results showed that with the added level of 0.1-1.4 mg/kg，standard addition recoveries of saccharin sodium，sodium benzoate were 99.5%-102.3%and 95.1%-102.1%，respectively.The relative standard deviation was 0.69%and 0.82%，respectively.The content of saccharin sodium and sodium benzoate in soy sauce were 3.27 mg/kg and 0.133 mg/kg，respectively.The method was with high recovery rate and good accuracy，and it can be used for saccharin sodium and sodium benzoate content analysis in soy sauce.

HPLC；soy sauce；saccharin sodium；sodium benzoate；detection

TS207.3

A

0254-5071（2015）11-0153-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.11.035

2015-10-14

邸萬山（1966-），男，副教授，本科，主要從事工業(yè)分析、食品分析、環(huán)境分析工作。