星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化四物湯中揮發(fā)油包合工藝

楊歡，何瑤，劉婷婷，傅超美，周莉江

實(shí)驗(yàn)室 四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川 成都 611137

《四物湯》出自于唐朝藺道人所著《仙授理傷續(xù)斷秘方》。全方由熟地黃、當(dāng)歸、白芍、川芎組成，具有補(bǔ)血和血的功效，主治營(yíng)血虛滯癥[1]。本方是補(bǔ)血常用方，也是調(diào)經(jīng)的基本方。因其常用于婦科疾病，故稱譽(yù)為“婦科圣方”。目前國(guó)內(nèi)已有四物合劑、四物片、四物膠囊、四物顆粒作為中成藥品種上市銷售。在四物湯系列制劑中：四物合劑、四物片、四物膠囊、四物顆粒制法項(xiàng)下均規(guī)定，當(dāng)歸、川芎須先經(jīng)水蒸氣蒸餾以充分獲取所含有的揮發(fā)性成分。同時(shí)，藥理研究表明，四物湯中揮發(fā)油具有抗炎、鎮(zhèn)痛、雙向調(diào)節(jié)子宮平滑肌等作用[2~3]，為四物湯中的重要活性成分[4]。四物湯中揮發(fā)油主要成分為藁本內(nèi)酯，但藁本內(nèi)酯性質(zhì)極不穩(wěn)定[5~6]。近年來，β-環(huán)糊精包合技術(shù)廣泛用于固體制劑中揮發(fā)油的包合，可增強(qiáng)揮發(fā)油對(duì)光熱的穩(wěn)定性，具有矯臭矯味，提高生物利用度，使液體藥物固體化[7]等優(yōu)點(diǎn)。本文先采用正交設(shè)計(jì)法對(duì)揮發(fā)油提取工藝進(jìn)行篩選，再利用星點(diǎn)設(shè)計(jì)優(yōu)化揮發(fā)油包合工藝，從而較好提取四物湯中的揮發(fā)油，并有效提高揮發(fā)油的穩(wěn)定性。

1 材料與儀器

1.1 藥材與試劑

熟地黃為玄參科植物地黃Rehmannia glutinosa Libosch.干燥塊根的炮制加工品（太極集團(tuán)四川綿陽(yáng)制藥有限公司，批號(hào)：1311007）。當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis(Oliv.)Diels.的干燥根（太極集團(tuán)四川綿陽(yáng)制藥有限公司，批號(hào)：1311008）。川芎為傘形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的根莖的炮制加工品（四川浩博藥業(yè)有限公司，批號(hào)：131201）。白芍為毛茛科植物芍藥Paeonia lactiflora Pall.的干燥根（太極集團(tuán)四川綿陽(yáng)制藥有限公司，批號(hào)：1312006）。以上中藥飲片，經(jīng)檢驗(yàn)符合《中國(guó)藥典》(2010年版)標(biāo)準(zhǔn)。β-環(huán)糊精（成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)：20120813）。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

揮發(fā)油提取器（北京西苑玻璃儀器公司），DZG- 6020 型真空干燥箱( 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)，HH-SJ集熱式恒溫磁力攪拌器（金壇市城東新瑞儀器廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 揮發(fā)油提取工藝研究

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，取四物湯中當(dāng)歸、川芎飲片（或粉末）各50 g，浸泡30 min，采用水蒸氣蒸餾法提取四物湯中的揮發(fā)油。按照L9(34) 正交設(shè)計(jì)法，以當(dāng)歸、川芎粉末粒度（A）、加水量(B)、提取時(shí)間(C)為主要影響因素，以揮發(fā)油得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)揮發(fā)油的提取工藝進(jìn)行篩選，因素水平見表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析見表3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：對(duì)四物湯揮發(fā)油提取的影響由大到小為：粉末粒度>提取時(shí)間>加水量。由方差分析可知：四物湯揮發(fā)油的提取過程中，粉末粒度對(duì)提取率具有極顯著影響（p<0. 01），提取時(shí)間具有顯著影響（p<0. 05），正交試驗(yàn)篩選的揮發(fā)油提取工藝為：A3B3C2，即取當(dāng)歸、川芎飲片粉碎成中粉，加入8倍量的水，水蒸氣蒸餾提取5 h。按照以上工藝進(jìn)行三批次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見表4）表明該工藝揮發(fā)油得率穩(wěn)定，其收率為0.89%。

表1 揮發(fā)油提取因素水平表

表2 揮發(fā)油提取L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果表

表3 方差分析表

表4 正交實(shí)驗(yàn)工藝驗(yàn)證結(jié)果

2.2 星點(diǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化四物湯揮發(fā)油包合工藝

2.2.1 星點(diǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用β-環(huán)糊精包合方法中的飽和水溶液法，以β-環(huán)糊精(g) :揮發(fā)油(mL)比例、包合溫度（℃）及包合時(shí)間(min)為自變量，以揮發(fā)油利用率（%）、包合物收得率（%）總評(píng)歸一值OD為因變量，每個(gè)因素設(shè) 5 水平，用代碼－α、－1、0、+1、+α來表示，因素水平見表5，星點(diǎn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表6。

揮發(fā)油的利用率和收得率是衡量包合效果的重要指標(biāo)，利用率(反映質(zhì)量)越高，收得率(反映產(chǎn)量)越高，包合效果越好。

揮發(fā)油利用率Y1%=包合物揮發(fā)油量 /（揮發(fā)油加入量×空白回收率）×100%

包合物收得率Y2%=包合物重量/（β-環(huán)糊精重量+揮發(fā)油重量）×100%

表5 星點(diǎn)設(shè)計(jì)因素水平表

2.2.2 空白回收試驗(yàn) 精密量取當(dāng)歸-川芎揮發(fā)油l mL，加無水乙醇1.5 mL使溶解，置500 mL燒瓶中，加蒸餾水100 mL和沸石數(shù)粒，連接揮發(fā)油提取器，按照《中國(guó)藥典》2010版附錄XD項(xiàng)下，揮發(fā)油測(cè)定法提取揮發(fā)油，至油量不再增加時(shí)停止加熱(約5小時(shí))，放置1 h，讀取揮發(fā)油量。計(jì)算空白回收率，測(cè)得回收率為91%。

2.2.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 β-環(huán)糊精包合物的制備方法：本文選用飽和水溶液法進(jìn)行包合。各試驗(yàn)號(hào)按星點(diǎn)設(shè)計(jì)因素水平表要求在設(shè)計(jì)溫度下配制β-環(huán)糊精飽和水溶液，加入揮發(fā)油l mL進(jìn)行包合實(shí)驗(yàn)。包合完畢后，置冰箱冷藏，抽濾，減壓干燥，即得白色粉末狀包合物。四物湯揮發(fā)油包合工藝試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表6

表6 四物湯揮發(fā)油包合工藝試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

17 0 0 0 70.4 79.86 0.784664 18 0 0 0 71.38 81.4 0.811439 19 0 0 0 71.87 80.62 0.808042 20 0 0 0 71.49 80.48 0.80262

2.2.4 總評(píng)歸一值（OD）的計(jì)算 將表6中揮發(fā)油利用率（Y1）、包合物收得率（Y2）數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)化為0-1間的歸一值,并將歸一值求算幾何平均數(shù)，得總評(píng)歸一值（Overall Desirability，OD）。OD=(d1×d2×.….×dn)1/n，n為指標(biāo)數(shù)，本實(shí)驗(yàn)的指標(biāo)數(shù)為2。揮發(fā)油利用率（Y1）、包合物收得率（Y2）取值均為越大越好。對(duì)取值越大越好的效應(yīng)采用Hassan方法分別進(jìn)行數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換求“歸一值”dmax。

2.2.5 模型擬合 以O(shè)D值為因變量對(duì)各因素進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式擬合，使用Design-Expert8.0軟件擬合模型。

多元線性回歸方程為：

二項(xiàng)式擬合方程為：

方差分析見表7，結(jié)果顯示該模型具有高度的顯著性，方差的可信度及擬合度均較好，故可用此模型對(duì)揮發(fā)油包合工藝進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。

表7 四物湯揮發(fā)油包合工藝方差分析

2.2.6 工藝優(yōu)化與預(yù)測(cè) 采用Design-Expert8.0軟件對(duì)包合工藝進(jìn)行優(yōu)化和預(yù)測(cè)。結(jié)果表明最優(yōu)工藝為：β-環(huán)糊精(g) :揮發(fā)油(ml) = 9.80:1，包合溫度為40℃，包合時(shí)間110 min，預(yù)測(cè)OD值為0.9882。效應(yīng)面圖及等高線圖見圖1到圖6。

圖1 環(huán)糊精比例和包合溫度對(duì)OD值的效應(yīng)面圖

圖2 環(huán)糊精比例和包合溫度OD值的等高線圖

圖3 環(huán)糊精比例和包合時(shí)間對(duì)OD值的效應(yīng)面圖

圖4 環(huán)糊精比例和包合時(shí)間對(duì)OD值的等高線圖

圖5 包合溫度和包合時(shí)間對(duì)OD值的效應(yīng)面圖

圖6 包合溫度和包合時(shí)間對(duì)OD值的等高線圖

2.2.7 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)效應(yīng)面優(yōu)化的最佳工藝進(jìn)行三批工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，制備四物湯揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物，其利用率為81.17%，收得率為87.4%（見表8）。結(jié)果表明，二項(xiàng)式擬合方程預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值的偏差為1.13 %，[偏差= (預(yù)測(cè)值-實(shí)測(cè)值) /預(yù)測(cè)值×100% ] ，說明二項(xiàng)式擬合效果良好，可信度高。

表8 最佳工藝驗(yàn)證結(jié)果

3 討論

四物湯中的揮發(fā)油是四物湯的一個(gè)重要活性部位，特別是其主要成分藁本內(nèi)酯具有調(diào)經(jīng)、鎮(zhèn)痛、抗炎、解熱等藥理作用，但藁本內(nèi)酯化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定[8~9]。為了充分發(fā)揮四物湯制劑中揮發(fā)油的療效，本研究將其用β-環(huán)糊精包合，不僅可以保留揮發(fā)油的生理活性，而且能掩蓋揮發(fā)油的氣味，提高制劑的生物利用度，便于制劑成型，更重要的是可以提高揮發(fā)油的穩(wěn)定性。星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面優(yōu)化法具有精密度高、預(yù)測(cè)值接近真實(shí)值等優(yōu)點(diǎn)[10]。本研究通過正交試驗(yàn)優(yōu)選出四物湯揮發(fā)油提取工藝，再利用星點(diǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化得到四物湯揮發(fā)油最佳包合工藝。經(jīng)驗(yàn)證，優(yōu)化后的工藝參數(shù)能較好提取四物湯中的揮發(fā)油，并使β-環(huán)糊精包合揮發(fā)油后的揮發(fā)油利用率、包合物收得率較高。該工藝穩(wěn)定可行，能有效提高四物湯制劑中揮發(fā)油穩(wěn)定性，為后期四物湯系列制劑制備工藝優(yōu)化及新制劑研發(fā)提供參考和依據(jù)。

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