高耐鎘硫酸鹽還原菌的篩選及鑒定

周冰玉，吳迎奔，陳 薇，劉 標(biāo)，許 雋，尹紅梅，賀月林

（湖南省微生物研究院， 湖南 長(zhǎng)沙410009）

隨著工業(yè)的快速發(fā)展，大量含重金屬離子的廢水排放到環(huán)境中，引起了嚴(yán)重的重金屬污染。一直以來(lái)，由于未得到有效治理，重金屬逐漸向江河湖海、地下水以及廢水流經(jīng)區(qū)域的土壤中積累，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和人類健康帶來(lái)嚴(yán)重威脅，尤其是重金屬鎘污染已成為一個(gè)全球性問(wèn)題[1-2]。因此，廢水中重金屬污染治理是當(dāng)前急需解決的重大問(wèn)題，也是目前許多科研工作者的研究熱點(diǎn)。

目前，廢水中鎘污染的治理方法主要有物理法、化學(xué)法和微生物修復(fù)法。但物理和化學(xué)方法所使用的材料較昂貴且使用壽命短，處理廢水的成本較高，易引起二次污染。而微生物修復(fù)法因其具有來(lái)源豐富、處理成本相對(duì)較低、對(duì)環(huán)境影響小等優(yōu)點(diǎn)，引起了科研工作者的廣泛關(guān)注[3-4]。

硫酸鹽還原菌是指一類能把硫酸鹽、亞硫酸鹽、硫代硫酸鹽等硫氧化物及元素硫還原形成硫化氫的細(xì)菌的統(tǒng)稱[5]。與其他類型的重金屬微生物修復(fù)菌劑相比，用硫酸鹽還原菌修復(fù)廢水鎘污染最大的優(yōu)勢(shì)在于其去除水體中鎘離子的效率更高，而且對(duì)多種重金屬離子都有去除效果[6]。作為一種可高效去除廢水中重金屬離子的微生物，硫酸鹽還原菌越來(lái)越被研究者們重視，從而廣泛應(yīng)用到工業(yè)廢水、灌溉用水、養(yǎng)殖廢水等的修復(fù)領(lǐng)域[7]。實(shí)驗(yàn)室從重金屬污染廢水中分離了12 株硫酸鹽還原菌，并對(duì)其鎘耐受能力和吸附能力進(jìn)行了測(cè)試，以期為硫酸鹽還原菌處理含鎘廢水提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

廢水樣品采自湖南某地工業(yè)區(qū)。試驗(yàn)所用的富集和固體培養(yǎng)基參照國(guó)家農(nóng)業(yè)部成都沼氣所的配方。富集培養(yǎng)基成分為：NaCl 2.0 g/L、Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O 0.5 g/L、NH4Cl 1.0 g/L、MgSO4·7H2O 2.0 g/L、Na2SO40.5 g/L、K2HPO40.5 g/L、70%乳酸鈉5 m l/L、酵母膏1.0 g/L，pH 值7.5。固體培養(yǎng)基即在上述培養(yǎng)基中按照20%的比例加入瓊脂粉。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 硫酸鹽還原菌的富集培養(yǎng) 取1 m L 廢水樣品加入裝有100 m L 液體培養(yǎng)基的鹽水瓶中，蓋好瓶蓋后放入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱中35℃靜置培養(yǎng)，待培養(yǎng)液變成墨黑色，用醋酸鉛試紙檢測(cè)有大量H2S 生成后轉(zhuǎn)接，如此重復(fù)5 次，每次接種量1%。

1.2.2 硫酸鹽還原菌的分離純化 將富集培養(yǎng)后的菌液稀釋到10-6，平板劃線，用封口膜密封后置厭氧培養(yǎng)箱中35℃培養(yǎng)7 d 后，從中挑取長(zhǎng)勢(shì)良好、濃黑色的單菌落于斜面中保存。

1.2.3 硫酸鹽還原菌的初步鑒定 在光學(xué)顯微鏡下觀察活體細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)特征、細(xì)胞形態(tài)；硫酸鹽還原菌的革蘭氏染色、芽孢染色和鞭毛染色方法見《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》[8]。

1.2.4 菌株對(duì)鎘的耐受能力 將獲得的12 株硫酸鹽還原菌，按2%的接種量接種于含5、10、20、40、80 mg/L 鎘離子的富集培養(yǎng)基中，于35℃、150 r/m in 厭氧培養(yǎng)7 d，然后將富集培養(yǎng)后的菌液涂布于固體培養(yǎng)基上，用封口膜密封后置厭氧培養(yǎng)箱中35℃培養(yǎng)，挑取各平板上的單菌落進(jìn)行斜面保藏。

1.2.5 菌株對(duì)鎘的吸附能力 將獲得的4 株耐鎘硫酸鹽還原菌，按2%的接種量接種于含20、40、80 mg/L鎘的富集培養(yǎng)基中，于35℃、150 r/m in厭氧培養(yǎng)7 d，設(shè)3個(gè)重復(fù)，以接等量無(wú)菌水和死菌體為對(duì)照。針筒取樣，10 000 r/m in離心10 m in，取上清液備用，對(duì)照采用同樣方法進(jìn)行處理。利用電感耦合等離子體發(fā)射光譜法測(cè)定各處理上清液中鎘的濃度。各菌株對(duì)培養(yǎng)液中鎘的吸附率（%）=（C0-Ct）/C0×100。其中，C0為蒸餾水對(duì)照上清液中鎘的濃度；Ct為吸附后上清液中鎘的濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 硫酸鹽還原菌的分離及初步鑒定

經(jīng)多次富集培養(yǎng)和分離，獲得12 株硫酸鹽還原菌，分別編號(hào)為S-1～S-12。12 株菌株的菌落特征和細(xì)胞形態(tài)特征見表1。其共同特征為菌落黑色，同為革蘭氏陰性菌，細(xì)胞形狀主要為桿狀或弧狀，不產(chǎn)芽孢，單極生鞭毛，運(yùn)動(dòng)特征以翻滾式運(yùn)動(dòng)和旋轉(zhuǎn)式運(yùn)動(dòng)為主；各菌株的區(qū)別僅在于菌體大小不同。對(duì)照《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌分類學(xué)手冊(cè)》中對(duì)脫硫弧菌屬硫酸鹽還原菌的描述：多弧狀，偶有桿狀，無(wú)芽孢，革蘭氏陰性，初步判定分離得到的菌株屬脫硫弧菌屬。

2.2 耐鎘硫酸鹽還原菌的分離純化

表1 各硫酸鹽還原菌的菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)特征的比較

對(duì)12 株硫酸鹽還原菌進(jìn)行分離純化，結(jié)果如表2所示，當(dāng)培養(yǎng)基中鎘離子濃度提高到80 mg/L，仍有4株菌株可以生長(zhǎng)，分別為S-3、S-11、S-5 和S-10。

2.3 高耐鎘硫酸鹽還原菌對(duì)鎘的吸附能力

4 株耐鎘硫酸鹽還原菌經(jīng)過(guò)7 d 培養(yǎng)后，各菌株對(duì)不同濃度含鎘培養(yǎng)液（分別含鎘20、40、80 mg/L）中Cd+的吸附能力見圖1～圖3。當(dāng)培養(yǎng)液含鎘20 mg/L時(shí)，各菌株對(duì)鎘的吸附能力較強(qiáng)，吸附率在87.27%±1.097%～84.37%±3.758%之間；隨著鎘濃度的增加，各菌株對(duì)鎘的吸附能力隨之降低；在鎘離子濃度為80 mg/L 的培養(yǎng)液中，菌株S-10 和S-11 的吸附能力較強(qiáng)，分別為70.63%±1.856%和72.27%±3.163%。耐鎘能力相對(duì)較弱的菌株卻表現(xiàn)出較強(qiáng)的鎘吸附能力。

當(dāng)培養(yǎng)基中鎘離子初始濃度為20 mg/L 時(shí)，死菌體細(xì)胞對(duì)溶液中鎘的吸附率為30.00%±3.835%～39.43%±2.639%；隨著鎘濃度的增加，死菌體對(duì)鎘的吸附能力亦隨之降低；在鎘離子濃度為80 mg/L 的培養(yǎng)液中，死菌體對(duì)鎘離子的吸附能力僅8.033%±0.404 1%～8.90 0%±0.435 9%。

表2 硫酸鹽還原菌在不同濃度含鎘培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況

圖1 4 株耐鎘菌株對(duì)含鎘20 mg/L 的培養(yǎng)液中Cd2+的吸附

圖2 4 株耐鎘菌株對(duì)含鎘40 mg/L 的培養(yǎng)液中Cd2+ 的吸附

圖3 4 株耐鎘菌株對(duì)含鎘80 mg/L 的培養(yǎng)液中Cd2+ 的吸附

3 結(jié)論與討論

經(jīng)過(guò)多次的富集分離，得到4 株高耐鎘硫酸鹽還原菌，其細(xì)胞呈弧形，無(wú)芽孢，為革蘭氏陰性，初步判定4 株高耐鎘硫酸鹽還原菌屬脫硫弧菌屬。下一步擬通過(guò)生理生化、16S rDNA 基因序列、G+C 含量的測(cè)定以及DNA-DNA 雜交分析進(jìn)一步判斷4 株高耐鎘硫酸鹽還原菌在分類學(xué)上的地位。

鎘耐受試驗(yàn)結(jié)果表明，S-3、S-5、S-10、S-11 菌株具有較強(qiáng)的鎘耐受能力，在鎘濃度高達(dá)80 mg/L 時(shí)，仍能正常生長(zhǎng)。4 株菌的鎘吸附試驗(yàn)結(jié)果顯示，各菌株活菌體對(duì)溶液中的鎘均有較強(qiáng)的吸附能力。在含鎘80 mg/L 的培養(yǎng)液中，菌株S-10 和S-11 的吸附能力較強(qiáng)，分別達(dá)70.63%±1.856%和72.27%±3.163%。

利用吸附能力強(qiáng)的微生物修復(fù)重金屬污染水體，可以克服物理和化學(xué)方法易造成二次污染的缺點(diǎn)，具有良好的應(yīng)用前景。試驗(yàn)獲得的4個(gè)菌株對(duì)鎘吸附能力強(qiáng)，效率高，有望成為處理含鎘廢水的理想菌種。但是，菌株S-3、S-5、S-10、S-11 的吸附機(jī)理及其對(duì)實(shí)際重金屬礦山污染廢水的處理效果仍需進(jìn)一步研究。

[1]劉麗君.水環(huán)境中鎘污染處理的研究進(jìn)展[J].環(huán)境科學(xué)與管理，2012，37（6）：124-127.

[2]黃寶圣.鎘的生物毒性及其防治策略[J].生物學(xué)通報(bào)，2012，40（11）：26-28.

[3]沈 萍，朱國(guó)偉.含鎘廢水處理方法的比較[J].污染防治技術(shù)，2010，23（6）：56-59.

[4]Carlos G R，Victor R T，Bruno G G.Cadmium and zinc removal from aqueous solutions by Bacillus jeotgali:pH，salinity and temperature effects[J].Bioresource Technology，2008，99（4）：3864-3870.

[5]馬保國(guó)，胡振琪，張明亮，等.高效硫酸鹽還原菌的分離鑒定及其特性研究[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2008，27（2）：608-611.

[6]Sponza D T.Investigation ofextracellular polymer substances（EPS）and physicochemical properties of different activated sludge flocs under steady-state conditions[J].Enzyme and Microbial Technology，2003，32（3-4）：375-385.

[7]潘響亮，王建龍，張道勇，等.硫酸鹽還原菌混合菌群胞外聚合物對(duì)Cu2+的吸附和機(jī)理[J].水處理技術(shù)，2005，31（9）：25-28.

[8]袁麗紅.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010.