堿提法提取栝樓籽蛋白工藝條件的優(yōu)化

林樹花，譚興和，李高陽，劉 陽

（1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南 長沙410125；2. 湖南省農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，湖南 長沙410125）

栝樓，又名吊瓜、瓜蔞、藥瓜，屬葫蘆科栝樓屬多年生草本植物，是我國傳統(tǒng)常用的中藥材，具有擴張冠脈，抗腫瘤、抗菌、抗衰老、抗艾滋病、抑制血小板凝集等功效，對消化系統(tǒng)有預(yù)防潰瘍和瀉下的作用[1]。栝樓籽外表有堅殼，呈深褐色，長橢圓形，籽肉略有澀味，富含油脂、蛋白等多種營養(yǎng)成分[2]。目前，國內(nèi)外對栝樓籽蛋白提取的研究還少見報道。堿提法作為一種傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)提取方法，因其適應(yīng)性廣、成本低、易操作而成為植物蛋白提取的首選方法[3]。因此，試驗擬通過正交優(yōu)化設(shè)計，確定堿提法提取栝樓籽分離蛋白的最佳工藝參數(shù)，為栝樓籽這一優(yōu)質(zhì)蛋白的生產(chǎn)應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試栝樓籽由湖南永州市金騰栝樓發(fā)展有限公司提供。試驗主要試劑有鹽酸、氫氧化鈉、硫酸、硫酸銅、硫酸鉀、硼酸、95%乙醇、無水乙醚等，均為分析純。試驗主要儀器有ZK 組織搗碎機（江蘇鹽城科學(xué)儀器廠）、79-1 磁力攪拌器（湖南湘儀科學(xué)儀器設(shè)備有限公司）、RE-5286A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）、DHG9071A 電熱恒溫干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）、ES-200 電子天平（長沙湘平科技發(fā)展有限公司）、AL204 分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）、DELTA 320pH 計（METTLERTOLEDO）、501型恒溫水浴鍋（金壇市岸頭國瑞實驗儀器廠）、TG16-WS 離心機（長沙湘智離心機有限公司）、全自動蛋白質(zhì)測定儀（福斯）、全自動凱氏定氮消化儀（福斯）、DB-2 不銹鋼電熱板（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）、FREEZONE4.5L 立式冷凍干燥機（LABCONCO）。

1.2 試驗方法

1.2.1 工藝流程 （1）脫脂栝樓籽粉的制備：栝樓籽→去殼→破碎→加入無水乙醚脫脂→過濾→蒸發(fā)濾液→烘干→脫脂栝樓籽粉末（以下簡稱栝樓籽粉）。（2）堿提法制備蛋白的過程：準確稱取一定量栝樓籽粉于50 m L 離心管中，按一定固液比加水混勻，用1 mol/L 氫氧化鈉調(diào)節(jié)堿提pH 值，放入水浴鍋中，在適宜的溫度下浸提一定的時間。然后取出冷卻，調(diào)節(jié)酸沉pH 值，沉淀后于5 500 r/m in 離心15 min，棄上清，取沉淀調(diào)pH 值至中性，冷凍干燥得分離蛋白粉。

1.2.2 試驗設(shè)計 （1）單因素試驗設(shè)計：①栝樓籽粉粒度大小，在固液比為1︰20，堿提pH 值為9.0，提取溫度50℃，提取時間60 m in 的條件下，分別考察過20目、60 目、100 目、140 目、180 目篩對栝樓籽蛋白得率的影響；②酸沉pH 值，在固液比為1︰20，堿提pH 值為9.0，提取溫度50℃，提取時間60 m in 的條件下，考察酸沉pH 值3.4、3.6、3.8、4.0、4.2 對栝樓籽蛋白得率的影響；③提取時間，在粒度大小100 目，固液比為1︰20，堿提pH 值為9.0，提取溫度50℃的條件下，分別考察40、50、60、70、80、90、100、110 m in 的提取時間對栝樓籽蛋白得率的影響；④提取溫度，在粒度大小100 目，固液比為1︰20，堿提pH 值為9.0，提取時間60 m in 的條件下，分別考察30、40、50、60、70℃溫度對栝樓籽蛋白得率的影響；⑤固液比，在粒度大小100目，堿提pH 值為9.0，提取溫度50℃，提取時間60 m in 的條件下，分別考察1︰10、1︰15、1︰20、1︰25、1︰30 的固液比（w︰v）對栝樓籽蛋白得率的影響；⑥堿溶pH 值，在粒度大小100 目，固液比為1︰20，提取溫度50℃，提取時間60 m in 的條件下，分別考察堿溶pH 值8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5 對栝樓籽蛋白得率的影響。（2）正交試驗：在單因素試驗的基礎(chǔ)上以提取時間、提取溫度、固液比、堿溶pH 值為考察對象，栝樓籽蛋白得率為響應(yīng)值，應(yīng)用L9（34）的正交設(shè)計優(yōu)化堿提法提取栝樓籽蛋白的工藝條件。正交試驗因素水平表見表1。

表1 堿提法正交試驗因素水平表

1.2.3 測定方法與計算 蛋白質(zhì)測定（GB 5009.5-2010）采用凱氏定氮法。蛋白質(zhì)得率計算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 栝樓籽粉粒度大小的選擇 從圖1 中可以看出，當栝樓籽粉粒度在20～100 目時，栝樓籽蛋白的得率幾乎呈線性上升趨勢，這是因為目數(shù)增加則顆粒越細小，其與溶液接觸的表面積越大，反應(yīng)加快，因此提取率增加；在100 目時，栝樓籽蛋白質(zhì)的得率達最大值（37.77%）；在100～140 目時，栝樓籽蛋白的得率逐漸下降，這可能是此時的粘度增大，對反應(yīng)反而形成了阻礙，因而造成提取率下降；而在140～180 目時，栝樓籽蛋白的得率又有所上升。這也許是因為隨著目數(shù)的增加，單位質(zhì)量的栝樓籽粉所含蛋白質(zhì)含量也隨之增加。因此，選擇100 目作為栝樓籽粉的最適粒度。

圖1 栝樓籽粉粒度大小對栝樓籽蛋白得率的影響

2.1.2 酸沉pH 值的確定 等電點法提取蛋白質(zhì)具有避免蛋白質(zhì)變性、盡可能減少雜質(zhì)、縮短工藝流程、降低生產(chǎn)成本等優(yōu)點[4]。由圖2 可知，pH 值在3.4～3.8 范圍時，栝樓籽蛋白的得率由26.97%上升至36.29%；當pH 值在3.8～4.0 時，得率有所下降；而在4.0～4.2 時，得率的變化不大。當pH 值為3.8 時，栝樓籽蛋白的得率最高（36.29%），即沉淀所得的栝樓籽蛋白質(zhì)最多，這是因為蛋白質(zhì)分子間的靜電排斥作用使蛋白質(zhì)聚集、沉淀、溶解度降低，而大多數(shù)食物蛋白質(zhì)的最低溶解度一般出現(xiàn)在等電點附近[5-6]，因此確定酸沉pH 值為3.8。

圖2 酸沉pH 值對栝樓籽蛋白得率的影響

2.1.3 最佳提取時間的選擇 從圖3 中可以看出，在40～70 m in 時，隨著時間的延長，栝樓籽蛋白的得率增加不明顯，這可能是因為水溫透過離心管傳導(dǎo)至樣液需要一定時間，故導(dǎo)致這一時間段內(nèi)栝樓籽蛋白的得率增加緩慢；而當提取時間由70 m in 增加至90 m in時，栝樓籽蛋白的得率陡然增加并達到最大值（36.41%）；而后隨著時間的延長得率變化不大。因此，選擇90 m in 為最佳提取時間。

圖3 提取時間對栝樓籽蛋白得率的影響

2.1.4 最適提取溫度的確定 由圖4 可知，在20～60℃時，隨著提取溫度的升高，栝樓籽蛋白的得率幾乎呈直線急劇上升；這是由于隨著溫度的升高，溶液中的分子運動活躍，反應(yīng)速度加快，因而得率上升顯著；在60℃時，栝樓籽蛋白的得率達到最大值（36.73%）；隨后，當溫度繼續(xù)增加時，栝樓籽蛋白的得率卻快速下降，這可能與部分蛋白質(zhì)由于高溫變性而未能被充分溶解有關(guān)。因此，確定60℃為最適提取溫度。

2.1.5 最佳固液比的確定 從圖5 中可以看出，隨著溶液量的增加，栝樓籽蛋白的得率呈現(xiàn)出現(xiàn)上升后下降的趨勢，在固液比為1︰20 時，得率達到最大值（35.08%）。因此，選擇1︰20 為最佳固液比。

2.1.6 堿溶pH 值的確定 由圖6 可知，當pH 值在8.0～8.5 時，栝樓籽蛋白的得率上升趨勢不明顯；當pH值在8.5～9.0 時，得率急劇上升；隨著pH 值的繼續(xù)增加，得率持續(xù)升高，并在9.5 時，達到最大值（35.09%）；當pH 值在9.5～10.5 時，得率有所降低，但降低幅度不大，此時的栝樓籽蛋白得率在30%以上。由此可見，栝樓籽蛋白在強堿環(huán)境下更容易溶入水中，故選擇pH 值9.5 為最適堿溶pH 值。

圖4 提取溫度對栝樓籽蛋白得率的影響

圖5 固液比對栝樓籽蛋白得率的影響

圖6 堿溶pH 值對栝樓籽蛋白得率的影響

2.2 正交試驗結(jié)果

由表2 可知，各因素對栝樓籽蛋白得率的影響由大到小依次排列為B（溫度）＞D（堿提pH 值）＞C（固液比）＞A（提取時間）；各因素的最優(yōu)水平分別是A1、B3、C2、D3；即堿提法提取栝樓籽蛋白的最佳工藝條件為：提取溫度70℃，堿提pH 值10.0，固液比1︰20，提取時間80 min。在此工藝條件下重復(fù)試驗3 次，栝樓籽蛋白的得率分別是42.89%、46.33%、43.88%，平均得率為44.37%。

表2 正交試驗結(jié)果

3 結(jié)論

試驗結(jié)果表明，以過100 目篩的脫脂栝樓籽粉為材料，在酸沉pH 值為3.8 的條件下通過堿提法提取其中的蛋白質(zhì)，最優(yōu)工藝條件如下：提取溫度70℃，堿提pH 值10.0，固液比1︰20，提取時間80 m in，在該工藝條件下蛋白質(zhì)的平均得率為44.37%。同時，在試驗過程中還發(fā)現(xiàn)堿提法具有適應(yīng)性廣、成本低、易操作等優(yōu)點，提取所獲得的栝樓籽蛋白能保持其原有的功能特性，可作為食品加工、保健品、食品添加劑等的原輔用料，為栝樓籽的進一步開發(fā)利用拓寬了途徑。

[1]王淑芬.野葫蘆的栽培技術(shù)[J].安徽農(nóng)學(xué)通報，2003，9（3）：70-71．

[2]胡興華，李國斌，蔡愛華，等.栝樓屬三種栝樓種子的營養(yǎng)分析[J].廣西科學(xué)，2004，11（3）：266-268.

[3]熊 拯，陳敏娥，張炳亮.油茶籽粕蛋白質(zhì)提取工藝及功能特性研究[J].糧油食品科技，2013，21（1）：28-30.

[4]逯與運，麻成金，黃 群，等.響應(yīng)面優(yōu)化超聲波輔助水酶法提取蠟梅籽蛋白[J].中國食物與營養(yǎng)，2010，（9）：59-63.

[5]李赤翎，夏 聞，俞 建，等.栝樓籽粗蛋白的提取研究[J].食品科技，2010，35（1）：218-219.

[6]Mitidieri FE，Wagner FR.Coalescence ofO/W emulsions stabilized by whey and isolate soybean proteins：influence of thermal denaturation，salt addition and competitive interfacial adsorption[J].Food Research，2002，35：547-557.