齊君++夏雪奎++劉新++袁文鵬++張永剛++賈愛(ài)榮++劉昌衡

摘 要：目的：對(duì)一株海參來(lái)源的鏈格孢屬真菌 （Alternaria sp.） 的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究。方法：利用大米培養(yǎng)基對(duì)該菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，通過(guò)薄層層析、柱層析、高效液相等分離手段，從鏈格孢屬真菌 （Alternaria sp.） 的乙酸乙酯提取物中分離獲得4個(gè)化合物。結(jié)果：利用質(zhì)譜和核磁共振等現(xiàn)代波譜分析方法，依次鑒定為：麥角甾-4，6，8（14），22-四烯-3-酮（1），麥角甾-6β-羥基-4，7，22-三烯-3-酮（2），Alternariol（3）和Alternariol methyl ether（4）。

關(guān)鍵詞：海參來(lái)源真菌 Alternaria sp. 次級(jí)代謝產(chǎn)物

中圖分類(lèi)號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1674-098X（2015）07（a）-0002-02

海參屬于海洋低等無(wú)脊椎動(dòng)物中的棘皮動(dòng)物門(mén)（Echinodermata）海參綱（Holothurioidea），是一種名貴的海洋動(dòng)物，其營(yíng)養(yǎng)豐富，是典型的高蛋白、低脂肪食物，其中的海參黏多糖、海參素、海參皂苷、氨基酸、多肽等活性成分，具有提高機(jī)體免疫力、抗疲勞、抗衰老、抗腫瘤等多種生理功能[1]。海參共附生微生物與其長(zhǎng)期共存，共同抵御海洋特殊的生態(tài)環(huán)境，在生態(tài)系統(tǒng)的進(jìn)化過(guò)程中與海參之間形成了良好的共生關(guān)系，能夠產(chǎn)生化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣、生物活性顯著的次級(jí)代謝產(chǎn)物，在活性天然產(chǎn)物的研究中有著巨大潛力[2-3]。本課題組已經(jīng)從海參來(lái)源的真菌中發(fā)現(xiàn)了結(jié)構(gòu)新穎的、具有細(xì)胞毒活性的二萜類(lèi)化合物，具有抑制血管生成活性的苯并呋喃類(lèi)化合物，以及具有多種生物活性的聚酮類(lèi)化合物[4-6]。本研究對(duì)一株海參來(lái)源的鏈格孢屬真菌 （Alternaria sp.） HS-7的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行了研究，通過(guò)薄層層析、柱層析、高效液相等分離手段，分離獲得4個(gè)化合物，經(jīng)質(zhì)譜和核磁共振等現(xiàn)代波譜分析，鑒定為：麥角甾-4，6，8（14），22-四烯-3-酮（1），麥角甾-6β-羥基-4，7，22-三烯-3-酮（2），Alternariol（3）和Alternariol methyl ether（4）。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

SW-CJ-1FD型超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；THZ-C型恒溫震蕩培養(yǎng)箱，江蘇太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；Waters 高效液相色譜系統(tǒng)（美國(guó)Waters公司）；安捷倫QTOF 6530液質(zhì)聯(lián)用儀；超導(dǎo)核磁共振儀 INOVA；石油醚，乙酸乙酯，二氯甲烷等為分析純，甲醇為色譜純（天津化學(xué)試劑廠）；柱層析硅膠（200目～300目），薄層硅膠GF254（青島海洋化工廠）；Sephadex LH-20。

1.2 菌種來(lái)源

菌株HS-7采集自威海成山頭海域的海參表皮分離得到，目前保存在山東省科學(xué)院生物研究所食品生物技術(shù)研究室。

1.3 方法

1.3.1 菌株的分離

將海參用無(wú)菌水清洗3次去除表面泥沙后，在海參各個(gè)部位分別切取小塊，然后用組織切片法和組織勻漿法進(jìn)行共附生微生物的分離。放入28℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，采用平板劃線法挑取單菌落將其轉(zhuǎn)接到另一新的平板上，進(jìn)行反復(fù)的劃線，獲得純的菌株。

1.3.2 菌株的發(fā)酵

從原始保藏菌種管中轉(zhuǎn)接到平板進(jìn)行復(fù)活，確定菌株純化后，將菌種接取適量到 PDA液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)2～3天，制備種子培養(yǎng)基。取種子培養(yǎng)液接入到大米培養(yǎng)基（120g/200mL海水，121℃，20min 高溫滅菌），發(fā)酵20瓶，在室溫下培養(yǎng)28天。

1.3.3 浸膏的制備和分離純化

發(fā)酵28天后，用3倍體積的乙酸乙酯浸泡提取大米培養(yǎng)基發(fā)酵物，減壓濃縮得到乙酸乙酯相浸膏（4.5g）。乙酸乙酯相浸膏經(jīng)反復(fù)的正相硅膠柱層析、凝膠柱層析以及半制備HPLC等方法分離得到4個(gè)化合物。

2 結(jié)果與討論

化合物1易溶于氯仿，1HNMR譜圖顯示甾體化合物的特征，1HNMR（CDCl3， 400MHz）δ：6.61（1H，d，J=9.6Hz，H-7）， 6.04（1H，d，J=9.6Hz，H-6），5.74（1H， s，H-4），5.23（2H，m，H-22，H-23），1.06

（3H，d，J=6.8Hz，H-21），1.00（3H， s，H-19），0.96（3H，s，H-18），0.93（3H，d，J=6.8Hz，

H-28），0.85（3H，d，J=6.8Hz，H-27）， 0.83（3H，d，J=6.8Hz，H-26）。通過(guò)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[7]的比較確定其結(jié)構(gòu)為麥角甾-4，6，8 （14），22-四烯-3-酮。

化合物2：1HNMR（CDCl3，600MHz） δ：6.12（1H，d，J=2.2Hz，H-4），5.14-5.25 （3H，overlapped，H-7，H-22andH-23），

4.97（1H，brs，H-6），1.18（3H，s，H-19），

1.03（3H，d，J=6.6Hz，H-21），0.92（3H，

d，J=6.6Hz，H-28），0.84（3H，d，J=6.6Hz，

H-27），0.82（3H，d，J=6.6Hz，H-26）， 0.61（3H，s，H-18）。通過(guò)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[8]的比較確定其結(jié)構(gòu)為麥角甾-6β-羥基-4，7， 22-三烯-3-酮。

化合物3：1HNMR（DMSO，600MHz）δ：11.77（1H，s，2-OH），11.09（1H，brs，

4-OH），10.42（1H，brs，10-OH），7.26（1H，d，

J=1.8Hz，H-5），6.72（1H，d，J=2.4Hz，H-7），endprint

6.65（1H，d，J=2.4Hz，H-9），6.38（1H，d，J

=1.8Hz，-H-3），2.71（3H，s，8-Me）；13CNMR（DMSO，150MHz）δ：165.9（C，C-13），

165.1（C，C-4），164.5（C，C-2），158.9（C，C

-10），153.0（C，C-12），138.7（C，C-8），138.5

（C，C-6），118.0（C，C-11），109.4（CH，C-7），

104.7（CH，C-9），102.0（CH，C-5），101.3（C，

C-1），97.8（CH，C-3），25.6（CH3，8-Me）；ESIMS[M-H]-m/z257.2。經(jīng)過(guò)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[9-10]比對(duì)，確定化合物為Alternariol。

化合物4：1HNMR（DMSO，600MHz）δ：7.14（1H，d，J=1.8Hz，H-5），6.65（1H，

d，J=1.8Hz，H-7），6.54（1H，d，J=1.8Hz，

H-9），6.52（1H，d，J=1.8Hz，H-3），3.89（3H，

s，4-OMe），2.70（3H，s，8-Me）；ESIMS [M-H]-m/z271.2。經(jīng)過(guò)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[9-10]比對(duì)，確定化合物為Alternariol methyl ether。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)海參來(lái)源的鏈格孢屬真菌 （Alternariasp.） HS-7次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究，得到4個(gè)次級(jí)代謝產(chǎn)物。分別為麥角甾-4，6，8（14），22-四烯-3-酮（1），麥角甾-6β-羥基-4，7，22-三烯-3-酮（2），Alternariol（3）和Alternariol methyl ether（4）。其中化合物1和2均為首次從海參來(lái)源的真菌中分離得到。研究已證實(shí)麥角甾酮具有利尿、抗腫瘤、免疫抑制、治療慢性腎臟病等多種生物活性[7]，為海洋藥物先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)提供了新資源。海參共附生微生物的研究為深入開(kāi)發(fā)海參資源奠定了基礎(chǔ)，提供了新思路。

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