呂意華,周 進,鄭 偉,高 巖,俞志明,鄭天凌*

(1.廈門大學生命科學學院,濱海濕地生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室,福建 廈門361102;2.清華大學深圳研究生院海洋科學與技術(shù)學部,廣東深圳518055;3.中國科學院海洋研究所,海洋生態(tài)與環(huán)境科學重點實驗室,山東青島266071)

一種基于RFLP分析的岡比亞藻檢測方法的建立

呂意華1,周 進2,鄭 偉1,高 巖3,俞志明3,鄭天凌1*

(1.廈門大學生命科學學院,濱海濕地生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室,福建 廈門361102;2.清華大學深圳研究生院海洋科學與技術(shù)學部,廣東深圳518055;3.中國科學院海洋研究所,海洋生態(tài)與環(huán)境科學重點實驗室,山東青島266071)

雪卡毒素作為一種脂溶性藻毒素近年來日益引起人們的重視,岡比亞藻(Gambierdiscus spp.)是雪卡毒素的主要產(chǎn)生藻.不同的岡比亞藻具有不同的生長特性和產(chǎn)毒性能,且存在地域差異性,因而對岡比亞藻的監(jiān)測存在較大挑戰(zhàn).建立一種快速簡單地鑒定岡比亞藻及其種群結(jié)構(gòu)的方法,是基礎科研和社會公眾關(guān)心的共性問題.為此,以加勒比海的10種岡比亞藻為受試生物,應用限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)分析技術(shù),通過生物軟件分析發(fā)現(xiàn)受試藻的限制性內(nèi)切酶Aci I具有良好的特異性和靈敏性,可有效區(qū)分目前已鑒定的10種岡比亞藻.驗證實驗中,通過與分離自野外環(huán)境的多株岡比亞藻進行酶切電泳和DNA測序,證實了Aci I的有效性和可靠性.結(jié)果表明,該Aci I分子具有檢測自然環(huán)境中岡比亞藻屬性和追蹤其種群結(jié)構(gòu)變化的潛力,對雪卡毒素的預判與風險評估具有重要的借鑒意義.

雪卡毒素;岡比亞藻;限制性片段長度多態(tài)性;Aci I;D1-D2

岡比亞藻(Gambierdiscus spp.)是一種單細胞的小型底棲甲藻,通常附著在大型藻或硬質(zhì)死亡珊瑚的表面,主要分布于35°N和35°S之間的加勒比海及熱帶和亞熱帶太平洋海域及印度洋,是雪卡毒素(ciguatera)前體——岡比亞毒素的重要產(chǎn)生者.早在古羅馬和唐朝時期便有因誤食雪卡毒素污染的魚類而中毒的事件[1-2].隨著全球氣候變暖,有害赤潮藻分布范圍擴大及珊瑚魚貿(mào)易和旅游事業(yè)發(fā)展,雪卡毒素中毒(ciguatera fish poisoning,CFP)危害呈越來越嚴重的趨勢[3-5].人們對雪卡毒素的關(guān)注,一方面是因為它威脅到水產(chǎn)品安全和公眾健康;另一方面也源自于它的生態(tài)指示價值,Hales等[6]認為雪卡毒素可作為熱帶海洋生態(tài)系統(tǒng)評估的敏感指示物,能間接反映環(huán)境變化所導致的生態(tài)破壞情況.

雪卡毒素的研究多聚焦于它的生產(chǎn)者——岡比亞藻.然而,以往受限于傳統(tǒng)分類學手段分辨率差等因素,人們一直將所有的岡比亞藻都籠統(tǒng)地歸類為毒性岡比亞藻(G.toxicus).隨著分子生物學的發(fā)展, r DNA測序被廣泛應用到岡比亞藻的分類鑒定中. Richlen等[7]采用r DNA測序和傳統(tǒng)的形態(tài)學相結(jié)合的方法在太平洋和加勒比海域分離鑒定了4種岡比亞藻,進一步的研究發(fā)現(xiàn)岡比亞藻具有豐富的種間多樣性,目前已有10種不同的岡比亞藻種被分離、鑒定和命名,另有2種潛在新種的基因型(G.ribotype 1和2)被報道[8].在已發(fā)現(xiàn)的主要岡比亞藻中,人們對其地理分布、產(chǎn)毒特性以及共存狀態(tài)有了一定的認識.在區(qū)域分布上,Litaker等[5]根據(jù)目前已報道的岡比亞藻,勾勒出了所有岡比亞藻種在全球的分布圖,其中G.carpenteri和G.caribaeus在太平洋和加勒比海域均有分布,而G.australes,G.pacificus,G. polynesiensis,G.toxicus和G.yasumotoi只分布于太平洋,G.belizeanus,G.carolinianus,G.ruetzleri, G.ribotype 1和G.ribotype 2則只在加勒比海域被發(fā)現(xiàn)[5].在毒性特征上,岡比亞藻毒性(毒素成分,毒性大小)存在明顯的種間差異,如G.toxicus和G. caribaeus屬低毒性種;G.austral,G.belizeanus,G. ribotype 2和G.pacificus為中等毒性種;而G. polynesiensis和G.excentricus為高毒性種[9-10].目前發(fā)現(xiàn)多種產(chǎn)毒岡比亞藻可以在某一區(qū)域共存,使得該海域的毒素組成具有多樣性和更替性.Holmes等[11]認為由于不同組合的岡比亞藻種會表現(xiàn)出不同的雪卡毒素,而環(huán)境參數(shù)作為不同岡比亞藻種選擇性生存和繁殖重要的驅(qū)動力,對其分布具有重要的選擇作用,是雪卡毒素形成的主要原因[11].

如何快速有效地追蹤某海域中環(huán)境選擇壓力下的岡比亞藻種群結(jié)構(gòu)變化對于解釋和預測雪卡毒素的暴發(fā)具有至關(guān)重要的作用.目前,人們對岡比亞藻種的鑒定主要依靠對核糖體大亞基(LSU)的多變區(qū)的克隆和測序來實現(xiàn)[12].DNA測序方法具有準確度和分辨率高的優(yōu)點,但是也存在實驗周期長、成本消耗大、操作相對繁瑣,以及無法分析某一岡比亞藻的具體豐度等問題.因此,開發(fā)經(jīng)濟簡單的岡比亞藻種群分析方法就成了研究者們亟需解決的問題.

限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)分析因技術(shù)成熟、成本低等優(yōu)點已被大量使用在微生物、真菌和赤潮藻等生物種群結(jié)構(gòu)的研究中,特別是隨著快速反應的限制性酶和熒光RFLP分析的發(fā)展,RFLP的應用越來越廣泛[13-15].岡比亞藻LSU的D1-D2區(qū)域具有一定的種間差異性.本實驗以RFLP技術(shù)為切入點,以岡比亞藻LSU中的多變區(qū)D1-D2為檢測區(qū)域,找到了限制性內(nèi)切酶Aci I.該組合酶具有區(qū)分現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的10種岡比亞藻種的潛能.在實際的研究工作中,我們選取了實驗室現(xiàn)有的7種岡比亞藻,獲得了這7種藻的酶切圖譜.為了進一步驗證該組合酶的特異性,我們對5株來自加勒比海域的野外岡比亞藻進行了酶切實驗和DNA測序驗證,結(jié)果顯示本次實驗建立的Aci I檢測方法與分子測序方法有很好的重現(xiàn)性.

1 材料與方法

1.1 藻種和培養(yǎng)條件

本次實驗中所用到的岡比亞藻或DNA樣品均由Donald M Anderson教授實驗室(伍茲霍爾海洋研究所,美國)惠贈,其中部分來自加勒比海域圣托馬斯島沿海.岡比亞藻培養(yǎng)在30 m L的K培養(yǎng)基中[16],培養(yǎng)溫度23℃,鹽度32,光照強度100μmol·m2/s,光照周期12 h∶12 h(光照∶黑暗).

1.2 限制性內(nèi)切酶的設計

從NCBI數(shù)據(jù)庫下載所有被收錄的岡比亞藻的D1-D3序列(約920 bp),根據(jù)引物序列使用Geneious Pro 6.1.2(Biomatters,Auckland,NZ)獲取目標片段D1-D2序列(約700 bp),然后分析各岡比亞藻種之間的D1-D2的進化關(guān)系,確定最大相似種(即RFLP分析的限制性藻種),最后利用DNAMAN 6.0和Restriction Enzyme Picker模擬酶切,獲得最佳的限制性內(nèi)切酶.

1.3 DNA提取和目標基因擴增

3 000 g離心收集10 m L對數(shù)期的藻細胞重懸于100μL的無菌水中,使用MoBIO PowerSoil DNA I-solation試劑盒(MoBio Laboratories,Inc.,Carlsbad, CA,USA)提取岡比亞藻總DNA,并采用1.5%(質(zhì)量分數(shù),下同)的TAE瓊脂糖凝膠電泳驗證.高變區(qū)D1-D2片段的擴增引物為D1R和D2C[17],PCR的反應體系(50μL)為:約5 ng的DNA模板,10×PCR緩沖液5μL(500 mmol/L KCL,100 mol/L Tris-HCl, p H 8.3),5μL d NTPs(0.8 mmol/L),4μL MgCl2(2 mmol/L),各2.5μL D1R和D2C引物(0.5μmol/ L),以及1 U Ampli Taq DNA聚合酶(Applied Biosystems Inc.,Foster City,CA,USA),用水補充到50 μL.PCR反應在Eppendorf Mastercycler Nexus PCR儀(Eppendorf,Hamburg,Germany)中進行,反應條件為:94℃預變性5 min;然后94℃變性30 s,57℃退火1 min,72℃延伸2 min,共35個循環(huán);最后72℃反應10 min.所有的樣品均設置2個重復,反應完成后將2個重復的PCR產(chǎn)物混合,再采用2%的TAE凝膠電泳檢測PCR結(jié)果.

1.4 產(chǎn)物純化及定量

PCR產(chǎn)物采用QIAquick DNA純化試劑盒(QIAGE,Valencia,CA,USA)進行純化,純化產(chǎn)物重溶在30μL的超純水中.使用PicoGreen核酸定量試劑盒(Life Technologies,Eugene,Oregon,USA)和紫外分光光度計(Spectramax M3)構(gòu)建標準曲線,對D1-D2純化產(chǎn)物進行定量(參照試劑盒操作流程).

1.5 限制性內(nèi)切酶酶切反應及凝膠電泳檢測

用Aci I快速限制性內(nèi)切酶對不同的岡比亞藻進行限制性酶切,預測的酶切位點和切片段大小如表1所示.酶切反應分兩步進行,反應體系為25μL,包含2.5 μL的10×酶切緩沖液,0.5 U的Spe I,HPYCH 4IV以及2μg DNA(用水補充到終體積25μL).37℃反應10 min后,再加入0.5 U的TaqαI加熱到65℃反應10 min,最后80℃保持20 min將酶失活.取10μL的反應產(chǎn)物使用2%的TAE凝膠電泳檢測各岡比亞藻的酶切產(chǎn)物大小.產(chǎn)物在1.5%的TAE膠中電泳(75 V,90 min),成像結(jié)果在凝膠成像儀上進行分析.

1.6 D1-D2的克隆與測序

使用p-GEM-T質(zhì)粒試劑盒(Promega,Madison, WI,USA),將新鮮的D1-D2擴增產(chǎn)物克隆和轉(zhuǎn)化至感受態(tài)的大腸桿菌中.然后根據(jù)藍白斑方法篩選陽性克隆,PCR驗證之后,選取陽性克隆子進行正反雙向測序(Eurofins MWG Operon,Ebersberg,Germany).

2 結(jié) 果

2.1 限制性內(nèi)切酶的篩查

由于不同岡比亞藻種LSU的多變區(qū)D1-D2通常只有數(shù)個堿基的差異,目前已經(jīng)商品化的限制性內(nèi)切酶很難獨自將所有的岡比亞藻區(qū)分開來,而不同的限制性內(nèi)切酶具有不同的酶切識別位點.本次實驗中我們嘗試尋找一種特異性的內(nèi)切酶,以期達到具有區(qū)分現(xiàn)有的岡比亞藻的能力.通過分析各種岡比亞藻之間的進化關(guān)系,獲取相似性最大的岡比亞藻種,在此基礎上確定所有岡比亞藻RFLP酶設計過程中的必需限制性內(nèi)切酶,然后再遵循組合酶含酶種類最少、酶切產(chǎn)物片段最少和經(jīng)濟實用的原則對潛在的限制性內(nèi)切酶進行了篩查,最終確定了限制性內(nèi)切酶Aci I (5′-C|CGC-3′)為靶向酶(表1).

表1 10種岡比亞藻預計限制性內(nèi)切酶酶切片段位點Tab.1 The Aci I recognition site for ten Gambierdiscus spp.

2.2 D1-D2擴增及定量

藻類LSU多變區(qū)D1-D2因種內(nèi)的高保守性,被研究者廣泛應用在藻類的基因分型和種類鑒定中.本研究中選用D1R和D2C引物對實驗室擁有的7種岡比亞藻的D1-D2區(qū)域進行PCR擴增(圖1).結(jié)果顯示該引物具有很好的特異性,所有PCR擴增產(chǎn)物在700～800 bp之間形成清晰、單一的電泳條帶,且與實際序列大小相當.

另外,為了保證所有酶切反應的DNA濃度一致,本研究使用PicoGreen核酸定量試劑盒來定量D1-D2擴增產(chǎn)物純化后的濃度.如圖2所示,當DNA質(zhì)量濃度分別為0,1,10,100,1 000 ng/m L時,DNA標準曲線擁有很好的線性關(guān)系(R2=0.999 9),但由于0,1, 10 ng/m L的數(shù)據(jù)結(jié)果非常接近,較難識別.通過該標準曲線的回歸公式計算,所有岡比亞藻的D1-D2酶切反應濃度都換算成2μg對應的DNA體積,以保證酶切結(jié)果的可比較性.

圖1 7種岡比亞藻LSU多變區(qū)D1-D2的PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 D1-D2 products of seven Gambierdiscus spp.

圖2 DNA定量標準曲線Fig.2 Standard curve of DNA quantification

2.3 限制性內(nèi)切酶酶切圖譜

如圖3所示,7種所檢測的岡比亞藻D1-D2區(qū)域經(jīng)Aci I限制性內(nèi)切酶消化之后,所得酶切圖譜具有較大的差異性.參照表1及圖3中電泳條帶的位置不難發(fā)現(xiàn),各岡比亞藻的酶切圖譜片段除了部分小片段以外,所有的DNA電泳片段都與預計的酶切結(jié)果相吻合.但是,由于數(shù)據(jù)庫中缺乏G.ribotype的D1-D2序列,本研究未能提供該型藻可能的限制性內(nèi)切酶酶切片段大小.

圖3 7種岡比亞藻D1-D2多變區(qū)的限制性內(nèi)切酶酶切圖譜Fig.3 D1-D2 digestion profiles of seven Gambierdiscus spp.

2.4 限制性內(nèi)切酶酶切應用

為了驗證組合酶對自然環(huán)境中岡比亞藻的鑒定能力,我們隨機選取了來自加勒比海圣托馬斯島沿海5株未知岡比亞藻種(HG,BB,KM,BP,TP)進行了酶切分析,酶切結(jié)果如圖4所示.對照表1和圖3不難發(fā)現(xiàn),HG,KM和TP的酶切片段大小相同且與G.carpenteri的酶切圖譜吻合,因此初步確定這3株藻為G.carpenteri;BB,BP 2株藻的酶切圖譜相同,且與G.carolinianus完全一致,因此可初步斷定這2株藻為G.carolinianus.

圖4 來自加勒比海域的5株岡比亞藻的D1-D2區(qū)酶切圖譜Fig.4 D1-D2 digestion profiles of five unknown Gambierdiscus spp.from Caribbean Sea

2.5 DNA測序驗證

為了進一步驗證酶切結(jié)果,我們對上述5株岡比亞藻LSU多變區(qū)D1-D2進行了DNA測序和Blast分析(某實驗未發(fā)表數(shù)據(jù)).其中HG,KM和TP的D1-D2測序結(jié)果與G.carpenteri 1S0510-22(KJ125101.1)的相似度為99%;BB和BP 2株岡比亞藻的D1-D2的BLAST比對顯示其與G.carolinianus NOAA6 6 (GU968522.1)的相似度達99%.因此,由于分子測序結(jié)果的高相似性,可以確定上述5株藻分別為G.carpenteri和G.carolinianus.分子鑒定方法與本次實驗所建立的RFLP酶切檢測法具有較好的匹配性,證實了RFLP方法的可靠性.

3 討 論

RFLP是近年發(fā)展起來的一項新型分子技術(shù),因其具有技術(shù)成熟、成本低廉等優(yōu)點,在微生物、真菌和赤潮藻等生物種群結(jié)構(gòu)的研究中已被廣泛應用[15,17].如Chang等[18]利用RFLP方法研究了厭氧條件下多環(huán)芳烴的降解,發(fā)現(xiàn)添加抑制甲烷生成的試劑后,萘和菲的降解被抑制,而且產(chǎn)甲烷細菌古生菌也被消除,從而證明產(chǎn)甲烷細菌參與多環(huán)芳烴的厭氧降解. Scholin等[19]利用RFLP對多種亞歷山大藻(Alexandrium)的LSU的D1-D3區(qū)進行了多種限制性內(nèi)切酶的酶切圖譜分析,為包括塔瑪亞歷山大藻(A.tamarense),鏈狀亞歷山大藻(A.catenella),A.fundyense和A.affine等的酶切鑒定提供了酶學基礎.RFLP技術(shù)操作簡單,能有效擺脫對設備的高要求和對成本的高依賴,與其他方法(如變性凝膠電泳、分子測序等)相比優(yōu)勢明顯,具有較大的生態(tài)應用價值.

在產(chǎn)毒藻類中,例如岡比亞藻,由于不同岡比亞藻的生長和產(chǎn)毒特性差別巨大,且分布具有明顯的地域性,如何快速獲得某熱帶或亞熱帶海域的岡比亞藻群信息對預測和監(jiān)控該海域的雪卡毒素具有非常重要的意義.以往針對岡比亞藻的鑒定有過RFPL的嘗試,然而,普通RFPL的檢測手段一般為瓊脂糖凝膠電泳,該檢測手段分辨率低,依賴于人眼觀察,具有明顯的局限性.且部分岡比亞藻在PCR過程總會產(chǎn)生假基因(pseudo-gene),導致其酶切結(jié)果存在誤差[20].隨后發(fā)展的末端限制性片段長度多態(tài)性分析法(terminal restriction fragment length polymorphism,TRFLP)利用熒光標記引物對樣品中DNA進行特異擴增,然后進行限制性內(nèi)切酶酶切,用帶熒光檢測器的序列儀對熒光標記片斷進行分離和識別,檢測末端限制片段的多樣性這種方法能夠得到一個群落的特征指紋圖譜,可大幅提高檢測該酶切方法的分辨率和檢測限.Joo等[15]根據(jù)12種不同藻種的核糖體小亞基多變區(qū)構(gòu)建了藻的T-RFLP庫,然后設計了包含2種限制性內(nèi)切酶的組合酶對2個不同水庫的藻類群體結(jié)構(gòu)進行了比較分析,成功鑒定了包括綠藻門、隱藻門等在內(nèi)的多種藻細胞.

本次實驗中我們聚焦于岡比亞藻,將RFLP技術(shù)用于岡比亞藻的分類鑒定中.以岡比亞藻D1-D2保守區(qū)域為切入點,篩查了10余種限制性內(nèi)切酶,按照產(chǎn)物最少、成本最省的原則優(yōu)選了Aci I內(nèi)切酶.該酶獲得的酶切圖譜具有較好的區(qū)分度,能有效識別目前已有的主要岡比亞藻種.從驗證的7種待檢藻種來看,條帶圖譜清晰、特異,能借助肉眼進行快速識別,證明了所建方法的有效性.隨后的野外樣品驗證中,分子測序方法與該方法有較好的吻合度和重現(xiàn)性,證實了Aci I內(nèi)切酶的可靠性.然而,受限于岡比亞藻的材料來源,我們未能獲得上述10種岡比亞藻種的酶切指紋圖譜,而只對本課題組已有岡比亞藻進行了酶切分析,給后續(xù)的研究遺留了一定的空間.在未來的工作中,我們將通過各種方式(國際交往、航次考察、種源購買)力爭獲取更為廣泛的樣品來源,獲取它們的酶切指紋圖譜,將Aci I作用下的酶切分型進行精細驗證,構(gòu)建岡比亞藻的指紋圖庫,為岡比亞藻的準確鑒定和快速識別提供理論依據(jù)和借鑒方法.

4 結(jié) 論

根據(jù)已有數(shù)據(jù)庫岡比亞藻的序列信息,經(jīng)生物軟件分析找到了限制性內(nèi)切酶Aci I可分離目前已鑒定的10種岡比亞藻.通過酶切電泳實驗獲得了本課題組擁有的已被鑒定的7種岡比亞藻種的酶切片段和電泳圖譜,然后通過對分離自加勒比海域的5株未知岡比亞藻的酶切和DNA測序分析,確定了這5株藻分別為G.carpenteri和G.carolinianus,因此我們認為Aci I能初步鑒定上述的岡比亞藻.為了進一步驗證和優(yōu)化該限制性內(nèi)切酶的特異性和檢測限,后續(xù)實驗應對目前已發(fā)現(xiàn)的所有岡比亞藻種進行酶切和測序驗證,為開發(fā)檢測靈敏度更高的熒光T-RFLP提供實驗基礎.

致謝 本文部分測序工作由伍茲霍爾海洋研究所(USA)的Mindy Richlen副教授協(xié)助完成,謹致感謝.

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LSU r DNA Based on RFLP Assays for Distinguishing Species of Gambierdiscus spp.

LüXi-hua1,ZHOU Jin2,ZHENG Wei1,GAO Xan3,XU Zhi-ming3,ZHENG Tian-ling1*
(1.Key Laboratory of the Coastal and Wetland Ecosystems,Ministry of Education,School of Life Sciences, Xiamen University,Xiamen 361102,China;2.The Division of Ocean Science and Technology,Graduate School at Shenzhen,Tsinghua University,Shenzhen 518055,China;3.Key Laboratory of Marine Ecology and Environmental Sciences,Institute of Oceanology,Chinese Academy of Sciences,Qingdao 266071,China)

Ciguatera fish poisoning(CFP)is a serious seafood poisoning syndrome caused by the consumption of seafood contaminated with ciguatoxins.The toxic organisms most commonly associated with CFP are benthic dinoflagellates in the genus Gambierdiscus.To establish molecular monitoring for the Gambierdiscus community in tropical seas,we analyzed the restriction fragment length polymorphism(RFLP)of large subunit ribosomal(LSU)rDNA sequences of D1-D2 region from ten Gambierdiscus species and several environmental samples.Results showed that the restriction enzyme AciI was able to identify LSU rDNA heterogeneities of Gambierdiscus species,repeatedly and sensitively.Therefore,the assay in this study could be established to monitor Gambierdiscus species in the environments and trace the changes of Gambierdiscus community in the ocean.

ciguatera;Gambierdiscus spp.;restriction fragment length polymorphism(RFLP);Aci I;D1-D2

10.6043/j.issn.0438-0479.2015.02.006

Q 331

A

0438-0479(2015)02-0182-06

2014-08-19 錄用日期:2014-11-04

國家海洋公益性行業(yè)專項(201305016,201305022);國家基金委-山東省聯(lián)合基金項目(U1406403)

*通信作者:wshwzh@xmu.edu.cn

呂意華,周進,鄭偉,等.一種基于RFLP分析的岡比亞藻檢測方法的建立[J].廈門大學學報:自然科學版,2015,54 (2):182-187.

:LüXihua,Zhou Jin,Zheng Wei,et al.LSU r DNA based on RFLP assays for distinguishing species of Gambierdiscus spp.[J].Journal of Xiamen University:Natural Science,2015,54(2):182-187.(in Chinese)