應(yīng)用多重PCR鑒定不同來(lái)源腸球菌

張秋菊

（鄭州市種畜場(chǎng)，河南 鄭州　450008）

應(yīng)用多重PCR鑒定不同來(lái)源腸球菌

張秋菊

（鄭州市種畜場(chǎng)，河南 鄭州450008）

對(duì)動(dòng)物糞便、食品及病變內(nèi)臟中分離的疑似腸球菌進(jìn)行種屬鑒定；設(shè)計(jì)腸球菌種屬特異性引物，利用多重PCR反應(yīng)對(duì)不同來(lái)源的219株疑似腸球菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增；219株疑似腸球菌中全部被鑒定為腸球菌屬細(xì)菌，其中，糞腸球菌82株（占37%）、屎腸球菌54株（占25%），另外有83株未能被鑒定到種的水平（占38%）；在已鑒定的腸球菌中，糞腸球菌和屎腸球菌是各種來(lái)源腸球菌中主要優(yōu)勢(shì)腸球菌種。

腸球菌；多重PCR；種屬鑒定

腸球菌是一類(lèi)球形或卵圓形、過(guò)氧化氫酶陰性、單個(gè)、成對(duì)或成鏈狀排列的革蘭氏陽(yáng)性條件致病球菌［1］，是人和動(dòng)物體內(nèi)上呼吸道、口腔或腸道的常居菌，當(dāng)其定植于其他黏膜部位時(shí)，能引起敗血癥、心內(nèi)膜炎等臨床感染，心內(nèi)膜炎的病死率可達(dá)21.0%～27.5%。腸球菌是全球范圍內(nèi)主要的醫(yī)院條件致病菌。

腸球菌作為動(dòng)物和人腸道正常菌群的一部分，其中屎腸球菌和糞腸球菌最為常見(jiàn)，除了主要存在于人和動(dòng)物的胃腸道，也廣泛分布于土壤、水、食物中。據(jù)報(bào)道腸球菌可以感染多種動(dòng)物，豬、家蠶、羔羊、驢等動(dòng)物體內(nèi)也可分離到腸球菌得致病菌株。另外，腸球菌在乳制品、肉制品等食品中普遍存在，由于該菌對(duì)熱、高鹽等加工處理具有耐受性，容易在食品中大量增殖，可以引起食物中毒［2-3］，也成為引發(fā)臨床感染的重要途徑。此外，食品中常常含有攜帶多重耐藥基因和毒力基因的腸球菌菌株，這些菌株可以通過(guò)食物鏈轉(zhuǎn)移到人體，從而引發(fā)更大的食品安全隱患。

腸球菌在食品和獸醫(yī)公共衛(wèi)生方面具有重要意義，而腸球菌不同，致病性和耐藥性也不相同，因此腸球菌種屬鑒定就顯得尤為必要。此外快速、準(zhǔn)確鑒定腸球菌的細(xì)菌種屬對(duì)防治腸球菌病也有重要意義。因此，在2011年11月份，筆者對(duì)不同來(lái)源分離的腸球菌種屬進(jìn)行鑒定，以期為腸球菌其他研究打下基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)菌株

219株疑似腸球菌，分別為羊糞34株、牛糞32株、豬糞35株、蜂猴糞便35株、生鮮肉樣34株、病變內(nèi)臟34株和食品15株。這些菌株均經(jīng)過(guò)pfizer選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)，革蘭氏染色鏡檢和分離純化，并于-70℃下50%的甘油中保存。試驗(yàn)時(shí)將其在BHI肉湯中活化后，再劃線(xiàn)于兔鮮血瓊脂平板上37℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑選一個(gè)菌落增菌后作為試驗(yàn)菌株。

1.2主要儀器

微量加樣器 Eppendorf；PTC-200型 PCR儀 MJ RESEARCH；3K30型冷凍離心機(jī)；S2-93自動(dòng)雙重純水蒸餾器；DYCP-31B型電泳槽；DYY-111-6B型電泳儀；sp-D垂直凈化工作臺(tái)；SIM-F124制冰機(jī)；AlphalmagerTM2200型凝膠成像儀；水浴恒溫振蕩器。

1.3主要試劑

瓊脂糖；Proteinase K；溶菌酶；苯酚/氯仿/異戊醇25∶24∶1；DL2000、DNA Marker；2 1 3 5BR.JY；腦-心浸萃液態(tài)培養(yǎng)基（BHI）；綠如藍(lán)染色劑；5%兔血平板和3%明膠平板；其他試劑。

1.4主要溶液和培養(yǎng)基的配制

1.4.1腦-心浸萃液態(tài)培養(yǎng)基（BHI） 取9 g培養(yǎng)基，加入250 ml單蒸水，使用磁力攪拌器加熱攪拌至完全溶解，121℃高壓滅菌20 min。

1.4.2溶菌酶用滅菌10 mmol/l Tris-Cl（pH8.0）立即溶解溶菌酶，配制成50 mg/ml濃度的貯存液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3蛋白酶K用高壓滅菌的50 mmol/l Tris（pH8.0）和1.5 mmol/l乙酸鈣溶液配制成濃度為20 mg/ml的溶液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.450 5SJT 乙酸（TAE） 242 g Tris、57.1 ml冰醋酸、100 ml 0.5mol/l EDTA（pH8.0），加單蒸水定容至1 000 ml，使用前稀釋成1 5 。

1.5細(xì)菌基因組的提取

按照UNIQ—10柱式細(xì)菌基因組提取試劑盒的說(shuō)明方法操作，并稍加改進(jìn)。其具體的步驟如下：

細(xì)菌培養(yǎng)物接種于5 ml BHI培養(yǎng)基中，37℃搖床（300 rpm）培養(yǎng)過(guò)夜；取過(guò)夜培養(yǎng)的細(xì)菌細(xì)胞（至多2 109個(gè)）加入離心機(jī)中，10 000 rpm離心1 min，收集菌體，盡量吸盡上清；加入180 μl溶菌酶溶液（20 mg/ml溶菌酶400 mg，20mM Tris-Hcl PH8.0 400 ml，2.5 m M EDTA 0.01450 g，ddH2O 19.4ml，1%TritonX-100 200μl），重懸菌液于37℃水中，水浴30～60 min；加入20 μl ProtenaseK溶液，充分混勻，56℃水浴30 min至細(xì)胞完全裂解。

加入200 μl BDbuffer，充分混勻。加入Bdbuffer后，可能產(chǎn)生白色沉淀，70℃水浴10 min沉淀會(huì)消失，如果溶液還沒(méi)有澄清說(shuō)明裂解不徹底。

加入200 μl無(wú)水乙醇，充分混勻。加入無(wú)水乙醇后，可能會(huì)產(chǎn)生半透明纖維狀懸浮物，不影響DNA的提取和應(yīng)用。

將吸附柱放入收集管中，用移液器將溶液和半透明纖維狀懸浮物全部加入吸附柱中，靜置2 min，12 000 rpm離心3 min，倒掉收集管內(nèi)的液體。

向吸附柱中加入500 μl Pwsolution，10 000 rpm離心1 min，倒掉收集管內(nèi)的液體。注意Pwsolution使用前要檢查是否按比例加入異丙醇。

向吸附柱中加入500 μl Wash soltion，10 000rpm離心1 min，倒掉收集管內(nèi)的液體（Wash soltion使用前請(qǐng)檢查是否按比例加入無(wú)水乙醇）。

將吸附柱重新放回收集管中，12 000 rpm離心2 min（注意此步不可以省略，否則殘余的乙醇會(huì)嚴(yán)重影響得率和后續(xù)試驗(yàn)）。

將吸附柱放入干凈的1.5ml離心管中，在吸附膜中央加入50～100μl預(yù)熱至60℃的Elution Buffer靜置3 min，10 000 rpm離心1 min。將所得到的DNA溶液置于-20℃保存或用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.6PCR擴(kuò)增

1.6.1引物的設(shè)計(jì)與合成［4］利用primer 5.0軟件自行設(shè)計(jì)；根據(jù)sodA基因序列設(shè)計(jì)糞腸球菌和屎腸球菌種特異性引物，引物序列見(jiàn)表1。

表1　屬特異性引物及種特異性引物序列

1.6.2PCR反應(yīng)體系如下

1.6.3PCR擴(kuò)增在PCR儀（PTC-200型）上進(jìn)行，反應(yīng)程序如下

95℃預(yù)變性5 min

94℃變性30 s

49℃退火1 min

72℃延伸1 min10 s

72℃終止10 min

用三蒸水作為空白對(duì)照。

1.6.4PCR擴(kuò)增結(jié)果判定取10 μl PCR共30個(gè)循環(huán)產(chǎn)物，經(jīng)含GoldView的1.5%瓊脂糖凝膠電泳，以Marker Dl2000為分子量對(duì)照。并用AlphalmagerTM2200型凝膠圖像分析系統(tǒng)拍攝。

2　結(jié)果與分析

2.1擴(kuò)增結(jié)果判定

以219株疑似腸球菌的基因組DNA為模板，去離子水為空白對(duì)照，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根據(jù)設(shè)計(jì)的腸球菌種屬判斷標(biāo)準(zhǔn)，出現(xiàn)屬特異性條帶（1 096bp）的為腸球菌屬細(xì)菌，同時(shí)出現(xiàn)屬（1 096bp）和糞腸球菌種特異性條帶（360bp）為糞腸球菌，同時(shí)出現(xiàn)屬（1 096bp）和屎腸球菌種特異性條帶（215bp）的為屎腸球菌。

2.2擴(kuò)增結(jié)果

根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，219株疑似腸球菌均在1 096bp處有明顯條帶，均為腸球菌屬細(xì)菌，其中，82株在3 60bp處出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，為糞腸球菌，54株在215bp處出現(xiàn)條帶，為屎腸球菌，而余下菌株除出現(xiàn)屬特異性條帶外，并未出現(xiàn)其他條帶。其結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　擴(kuò)增結(jié)果統(tǒng)計(jì)

由表2可知，不同來(lái)源的219株疑似腸球菌中，219株均為腸球菌屬細(xì)菌，其中，糞腸球菌82株（占37%）、屎腸球菌54株（占25%），另外有83株雖被鑒定為腸球菌屬細(xì)菌（占38%），但究竟是何種腸球菌本次無(wú)法鑒定。

從檢測(cè)結(jié)果中糞腸球菌和屎腸球菌的比例來(lái)看，各個(gè)來(lái)源菌株擴(kuò)增結(jié)果有明顯差異：羊糞中屎腸球菌與糞腸球菌分布水平相當(dāng)；牛糞中屎腸球菌為主要優(yōu)勢(shì)菌種，未檢測(cè)出糞腸球菌；豬糞中以屎腸球菌為主要優(yōu)勢(shì)菌種；野生蜂猴糞便中糞腸球菌為主要優(yōu)勢(shì)菌種，未檢測(cè)出屎腸球菌；生鮮肉樣中以糞腸球菌為主要優(yōu)勢(shì)菌種，未檢測(cè)出屎腸球菌；病變內(nèi)臟中以屎腸球菌為主要優(yōu)勢(shì)菌種，且鑒定結(jié)果全部為糞腸球菌和屎腸球菌，無(wú)其他種腸球菌；熟食食品中以糞腸球菌為主要優(yōu)勢(shì)菌種。

3　小結(jié)與討論

該次對(duì)豬、牛、羊、蜂猴糞便以及生鮮肉、熟肉食和病豬內(nèi)臟分離的219株疑似腸球菌進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果全部為腸球菌屬細(xì)菌，其中，糞腸球菌82株、屎腸球菌54株，另外有83株被鑒定為腸球菌屬細(xì)菌。

不同來(lái)源樣品中腸球菌種類(lèi)不同，35株蜂猴糞便中糞腸球菌18株，未鑒定腸球菌17株，糞腸球菌為優(yōu)勢(shì)腸球菌種，未檢測(cè)出屎腸球菌；32株牛糞便中屎腸球菌10株，未鑒定腸球菌22株，未檢測(cè)出糞腸球菌，屎腸球菌為優(yōu)勢(shì)腸球菌種；35株豬糞便中糞腸球菌8株，屎腸球菌11株，未鑒定腸球菌16株，屎腸球菌為優(yōu)勢(shì)腸球菌種；34株羊糞便中糞腸球菌與屎腸球菌均為10株，未鑒定腸球菌14株；34株生鮮肉樣中糞腸球菌23株，未鑒定腸球菌11株，未檢測(cè)出屎腸球菌，糞腸球菌為優(yōu)勢(shì)腸球菌種；15株食品中糞腸球菌11株，屎腸球菌1株，未鑒定腸球菌3株，糞腸球菌為優(yōu)勢(shì)腸球菌種；34株病變內(nèi)臟中糞腸球菌12株，屎腸球菌22株，屎腸球菌為優(yōu)勢(shì)腸球菌種。

據(jù)報(bào)道豬糞中糞腸球菌占40%，屎腸球菌為60%，市場(chǎng)鮮豬肉中糞腸球菌占84.6%，屎腸球菌為15.4%［5］，測(cè)定的豬糞便中屎腸球菌為主要優(yōu)勢(shì)菌種，肉樣和食品中糞腸球菌為主要優(yōu)勢(shì)菌種，與報(bào)道數(shù)據(jù)相符。

野生蜂猴僅有糞腸球菌和其他種腸球菌，未檢測(cè)到屎腸球菌，屎腸球菌在環(huán)境、人和已報(bào)道的動(dòng)物糞便中均具有相當(dāng)高的含量，而該次未能檢測(cè)到，這是否與蜂猴的動(dòng)物種屬、生活環(huán)境和食性等情況有關(guān)，有待于進(jìn)一步研究。肉品中糞腸球菌較高可能是在屠宰或運(yùn)輸銷(xiāo)售時(shí)被糞腸球菌污染了。

目前，腸球菌可以通過(guò)傳統(tǒng)方法和分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行鑒定，但生化試驗(yàn)鑒定腸球菌往往是費(fèi)時(shí)的或不可靠的，對(duì)于單重PCR鑒定細(xì)菌的種屬，其特異性和靈敏度與多重PCR相似但需要的時(shí)間長(zhǎng)。但多重PCR鑒定又受試驗(yàn)設(shè)計(jì)限制，該次應(yīng)用多重PCR方法雖然能夠?qū)S腸球菌和屎腸球菌進(jìn)行鑒定，但對(duì)其他種類(lèi)腸球菌還無(wú)法鑒定到種的水平。因此，研究其他腸球菌的多重PCR方法，對(duì)于快速鑒定其他腸球菌顯得尤為必要。

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1004-5090（2015）10-0003-03

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