陳仕學(xué)等

摘要：用微波輔助提取茶葉蛋白質(zhì)，并用考馬斯亮藍(lán)染色法測定蛋白質(zhì)的含量，以NaOH濃度、料液比、微波時間和微波功率為參考因素設(shè)計試驗，通過單因素試驗和正交試驗確定了茶葉蛋白質(zhì)的最佳提取工藝參數(shù)，篩選出最佳組合。結(jié)果表明，微波輔助提取茶葉蛋白質(zhì)的最佳條件為：NaOH濃度0.12 mol/L，料液比1∶30（g∶mL），微波時間115 s，微波功率440 W。在此條件下，茶葉蛋白質(zhì)提取率達到11.26%。另外還對茶葉蛋白質(zhì)的吸水性、吸油性和持水性進行了研究，其中提取得到的茶葉蛋白質(zhì)吸水量為1.797 mL/g，吸油量為0.998 mL/g，持水能力為 1.64 g/g。由此可知，微波輔助提取法大大縮短了浸提時間，提高了茶葉蛋白質(zhì)的提取率。

關(guān)鍵詞：微波輔助提?。徊枞~；蛋白質(zhì)；理化性質(zhì)

中圖分類號：S571.1；TS272.2 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）18-4552-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.18.040

茶樹（Camellia sinensis）屬于山茶科山茶屬多年生常綠木本植物，中國有14屬397種。茶葉在人們的生活中具有飲用、營養(yǎng)、保健、藥理、人文等多元價值[1]，可以作為保健飲品開發(fā)[2]，中國具有豐富的茶葉資源[3]。茶葉中蛋白質(zhì)含量一般占茶鮮葉干重的15%～30%，其中大部分為非水溶性蛋白質(zhì)[4]，只有1%～2%的蛋白質(zhì)為水溶性蛋白質(zhì)[5]。目前，對茶葉蛋白質(zhì)的研究主要有：李燕等[6]用小鼠進行茶葉蛋白質(zhì)預(yù)防輻射，發(fā)現(xiàn)茶葉蛋白質(zhì)具有清除超氧陰離子的功能，可抵抗電離輻射所引起的致突變效應(yīng)。活潑等[7]研究發(fā)現(xiàn)非水溶性茶葉蛋白質(zhì)有明顯的降血脂效果，對抗動脈粥樣硬化及冠心病有一定的預(yù)防作用。陸晨等[8]在研究茶葉蛋白質(zhì)對面團流變學(xué)特性的影響中，得出茶葉蛋白質(zhì)可以作為有效的面粉營養(yǎng)強化劑和面粉品質(zhì)改良劑。由此可知，茶葉蛋白質(zhì)是一種既有營養(yǎng)又有多種保健功能的蛋白質(zhì)。

目前對茶葉蛋白質(zhì)的提取工藝研究鮮有報道，有關(guān)的報道僅集中于茶葉蛋白質(zhì)的單一堿溶法提取工藝研究[9]。微波提取技術(shù)是近年來新發(fā)展的一種方法，其提取技術(shù)因操作方便、提取效率高、能耗小等特點，已被廣泛應(yīng)用到食品原料及天然產(chǎn)物中目標(biāo)功效成分的提取[10]。因此，本試驗以梵凈山綠茶為原料，用微波輔助提取茶葉蛋白質(zhì)，得出提取茶葉蛋白質(zhì)的最佳工藝條件，并對其理化性質(zhì)進行研究，旨在為茶葉蛋白的深加工提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

材料：梵凈山綠茶。

試劑：NaOH、牛血清白蛋白質(zhì)、活性炭、90%乙醇、85%磷酸、乙酸乙酯、鹽酸；標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：稱取10 mg牛血清白蛋白質(zhì)，溶于去離子水并定容至100 mL，制成 0.1 mg/mL的原液；考馬斯亮藍(lán)G-250蛋白試劑：稱取100 mg考馬斯亮藍(lán)G-250，溶于50 mL95%乙醇中，加入85%的磷酸100 mL，用去離子水定容到1 000 mL。

儀器：FW80型萬能粉碎機，北京科偉永興儀器有限公司；秒表，深圳市超速達實業(yè)有限公司；MM823EC8-PS（X）型美的微波爐，佛山市順德區(qū)美的微波電器制造有限公司；101-3型電熱鼓風(fēng)干燥箱，北京科偉永興儀器有限公司；紫外分光光度計，北京普析通用儀器公司；80-2型離心沉淀機，江蘇金壇市中大儀器廠；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 取6支試管，向各試管分別加入0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，去離子水補足1 mL，分別加5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250蛋白試劑，輕輕搖勻。放置2 min后在595 nm波長下比色測定（比色應(yīng)在 1 h內(nèi)完成）。以牛血清白蛋白含量為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪出蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線[11]，得出回歸方程y=kx+b。

1.2.2 茶葉蛋白質(zhì)的提取工藝流程 原料預(yù)處理（將茶葉用乙酸乙酯進行清洗除脂，干燥后粉碎備用）→茶蛋白質(zhì)浸提（微波輔助堿提，制得茶葉蛋白質(zhì)提取液）→真空抽濾、取濾液→脫色（活性炭脫色30 min，每100 mL提取液加入4 g活性炭）→抽濾取濾液→得到茶葉蛋白質(zhì)提取液→考馬斯亮藍(lán)染色法測定蛋白質(zhì)含量[12-14]。

1.2.3 單因素試驗

1）NaOH濃度。準(zhǔn)確稱取1 g預(yù)處理好的茶葉6份，以料液比為1∶30（g∶mL，下同）分別加入0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14 mol/L NaOH溶液，微波功率為440 W，微波輔助提取時間為75 s，按照“1.2.2”的方法進行試驗，探討不同NaOH濃度對其提取率的影響。

2）料液比。準(zhǔn)確稱取1 g預(yù)處理好的茶葉6份，料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60，微波功率為440 W，微波輔助提取時間為75 s，按照“1.2.2”的方法進行試驗，探討不同料液比對其提取率的影響。

3）微波時間。準(zhǔn)確稱取1 g預(yù)處理好的茶葉6份，微波時間分別為55、75、95、115、135、155 s，按照“1.2.2”的方法進行試驗，探討不同時間對其提取率的影響。

4）微波功率。準(zhǔn)確稱取1 g預(yù)處理好的茶葉6份，微波功率為136、264、440、616、800 W，按照“1.2.2”的方法進行試驗，探討不同功率對其提取率的影響。

1.2.4 正交試驗 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以NaOH濃度、料液比、微波時間、微波功率為試驗因素，以茶葉蛋白質(zhì)提取率為指標(biāo)，進行4因素3水平的正交試驗。

1.2.5 茶葉蛋白質(zhì)的性質(zhì)研究

1）茶葉蛋白質(zhì)干品的制備。利用堿提酸沉法，將得到的茶葉蛋白質(zhì)提取液中加入0.01 moL/L鹽酸并調(diào)節(jié)pH至蛋白質(zhì)的等電點使蛋白質(zhì)沉淀出來，離心后取沉淀烘干制成蛋白質(zhì)干品備用。

2）吸水性測定。稱取0.5 g干燥茶葉蛋白質(zhì)置于干燥離心管中，再加入5 mL去離子水，在室溫下靜置30 min，4 000 r/min離心30 min，測量上清液體積，用原水體積減去離心后上清液體積即為蛋白樣品的吸水性。

吸水性=（原水體積-離心后上清液體積）/蛋白質(zhì)質(zhì)量

3）吸油性測定。取0.5 g干燥茶葉蛋白質(zhì)置于干燥離心管中，加5 mL 清油置于離心管中，混勻1 min 后，在室溫下靜置30 min，4 000 r/min離心30 min，測量游離油體積，原油量減去游離油量即為蛋白質(zhì)樣品所吸油性。

吸油性=（原油量-離心后游離油量）/蛋白質(zhì)質(zhì)量

4）持水性測定。稱取0.5 g茶葉蛋白質(zhì)置于干燥離心管中，加入10 mL去離子水，攪拌均勻后80 ℃水浴加熱60 min，冷卻至室溫，4 000 r/min離心10 min后去上清液，擦干離心管內(nèi)壁和外壁的水分，稱取沉淀的質(zhì)量，計算出每毫克蛋白質(zhì)樣品的持水性[15]。

持水性=沉淀質(zhì)量/樣品質(zhì)量

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

用考馬斯亮藍(lán)對標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液進行染色， 595 nm波長下測定其吸光度，以蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），得出回歸方程y=7.985 0x-0.009 0 （R2=0.999 2）。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 NaOH濃度對提取率的影響 NaOH濃度對茶葉蛋白質(zhì)提取率的影響見圖2。由圖2可知，隨著NaOH濃度的升高，茶葉中蛋白質(zhì)的提取率不斷增大，當(dāng)NaOH濃度達到0.12 moL/L時，茶葉蛋白質(zhì)的提取率達到最大，之后隨著NaOH濃度的持續(xù)增加蛋白質(zhì)提取率又有了下降的趨勢，表明在NaOH溶液為0.12 moL/L時，大部分蛋白質(zhì)溶出，當(dāng)NaOH濃度較高時，會使蛋白質(zhì)變性和水解，還會改變蛋白質(zhì)的營養(yǎng)學(xué)特性，生成賴氨酰丙氨酸[16]。另外，堿濃度過高還會影響分離效果[17]。所以隨著NaOH濃度的持續(xù)增加，蛋白質(zhì)提取率逐漸下降。因此，確定微波輔助提取茶葉蛋白質(zhì)的最佳NaOH濃度為0.12 moL/L。

2.2.2 料液比對提取率的影響 不同料液比對茶葉蛋白質(zhì)提取率的影響見圖3。由圖3可知，隨著料液比的降低，茶葉蛋白質(zhì)的提取率逐漸增大，當(dāng)料液比達到1∶30時提取率達到最大，隨著料液比的持續(xù)降低，茶葉中蛋白質(zhì)的提取率又逐漸下降，另外溶劑太多，會造成提取液中蛋白質(zhì)濃度偏低，也會增加后面處理的負(fù)擔(dān)。所以料液比1∶30為其最佳料液比。

2.2.3 微波時間對提取率的影響 不同時間對茶葉蛋白質(zhì)提取率的影響見圖4。由圖4可知，開始時隨著微波時間的增加，茶葉蛋白質(zhì)提取率呈現(xiàn)增大的趨勢，當(dāng)微波提取時間達到135 s時茶葉蛋白質(zhì)提取率達到最大，然后隨著時間的延長，茶葉蛋白質(zhì)提取率呈下降趨勢，可能是由于微波時間過長，持續(xù)的高溫使茶葉蛋白質(zhì)變性失活，變性失活的蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)不能染色，導(dǎo)致其提取率下降。所以微波輔助提取茶葉蛋白質(zhì)的最佳時間為135 s。

2.2.4 微波功率對提取率的影響 不同功率對茶葉蛋白質(zhì)提取率的影響結(jié)果見圖5。由圖5可知，隨著微波功率的增大，茶葉蛋白質(zhì)提取率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，當(dāng)微波功率達到440 W時，提取率達到最大，之后隨著微波功率的不斷增大，茶葉蛋白質(zhì)的提取率反而逐漸下降，這可能是由于微波功率過大易造成溫度過高而使蛋白質(zhì)變性失活，最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)的提取率下降。所以微波輔助提取茶葉蛋白質(zhì)的最佳功率為440 W。

2.3 正交試驗結(jié)果

為了研究不同條件對蛋白質(zhì)提取率的影響和確定最佳蛋白質(zhì)提取工藝，根據(jù)以上單因素試驗選擇了對提取率影響較大的NaOH濃度、料液比、微波時間、微波功率4個因素3水平（表1），采用 L9（34）進行試驗，以蛋白質(zhì)提取率為指標(biāo)，結(jié)果見表2。由表2正交試驗結(jié)果可知，在堿性條件下利用微波提取茶葉蛋白質(zhì)過程中，發(fā)現(xiàn)影響茶葉蛋白提取率的主次因素依次為：料液比>微波時間>微波功率>NaOH濃度，提取的最佳方案為A2B2C1D2，即NaOH濃度為0.12 moL/L、料液比為1∶30、微波提取時間為115 s、微波功率為440 W。為了考察上述提取工藝的穩(wěn)定性，按該工藝的最佳條件，進行5次重復(fù)性試驗得出茶葉蛋白質(zhì)的平均提取率為11.26%，優(yōu)于正交試驗中的任何一組，且RSD為2.29%，說明該工藝穩(wěn)定。

2.4 精密度試驗

在最佳提取工藝條件下稱取5份樣品提取蛋白質(zhì)，用考馬斯亮藍(lán)染色法對提取的蛋白質(zhì)溶液進行染色，并用紫外分光光度計測量其吸光度，計算茶葉蛋白質(zhì)提取率[18]，5次試驗的RSD為0.17%，說明用此方法測量茶葉蛋白質(zhì)提取率的精密度較好。

2.5 蛋白質(zhì)性質(zhì)測定

蛋白質(zhì)的吸水性表示蛋白質(zhì)的水化能力，即蛋白質(zhì)分子通過直接吸附及松散結(jié)合而在其分子周圍形成水化層的能力。蛋白質(zhì)的吸油性是指蛋白質(zhì)與游離脂肪相結(jié)合的能力[19]。蛋白質(zhì)的持水性是蛋白質(zhì)功能特性中的一種，是指蛋白質(zhì)在一定條件下承受熱加工后保持水分的能力。試驗對茶葉蛋白質(zhì)的吸水性、吸油性和持水性進行了測定，測得茶葉蛋白質(zhì)的吸水量為1.797 mL/g，吸油量為0.998 mL/g，持水能力為1.64 g/g。

3 結(jié)論

試驗以微波輔助法提取梵凈山綠茶茶葉中的蛋白質(zhì)，分別對NaOH濃度、料液比、微波功率、微波時間等因素進行單因素試驗，并通過正交試驗得到的最佳提取工藝條件為：NaOH濃度為0.12 moL/L，料液比為1∶30，微波時間為115 s，微波功率為440 W，在此條件下茶葉蛋白質(zhì)的提取率為11.26%。與傳統(tǒng)提取工藝比較，微波輔助提取用時少，速度快，效率高。此外，試驗還對茶葉蛋白質(zhì)的吸水性、吸油性和持水性進行了研究，結(jié)果表明，吸水量為1.797 mL/g，吸油量為0.998 mL/g，持水能力為1.64 g/g。茶葉蛋白質(zhì)雖然大部分為非水溶性蛋白質(zhì)，不能直接被人體吸收利用，但若對其進行改性，可以被人體吸收利用，本試驗對茶葉蛋白質(zhì)的性質(zhì)進行初步研究，為以后對茶葉的深加工研究提供一定依據(jù)。

參考文獻：

[1] 胡曉倩，楊代群.茶葉蛋白的研究現(xiàn)狀分析及發(fā)展對策研究[J].資源開發(fā)與市場，2010（1）：4-6.

[2] 鄒小明，謝 騫，朱立成，等.茶葉蛋白的提取工藝研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007（1）：169-171.

[3] 許詠梅.中國茶葉出口國際競爭力比較分析[J].世界農(nóng)業(yè)，2006（1）：26-28.

[4] 王洪新，胡昌云.茶葉蛋白質(zhì)的改性及其功能性質(zhì)研究[J].食品科學(xué)，2005（6）：135-140.

[5] 李 娟，活 潑，楊海燕.茶葉中非水溶性蛋白質(zhì)提取工藝及功能性質(zhì)的研究[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006（2）：150-153.

[6] 李 燕，蔡東聯(lián)，夏雪君，等.茶蛋白液預(yù)防輻射引起的突變效應(yīng)[J].癌變·畸變·突變，2001（1）：32-36.

[7] 活 潑，黃光榮，張曉暉，等.非水溶性茶葉蛋白降血脂作用的研究[J].茶葉科學(xué)，2005（2）：95-99.

[8] 陸 晨，張士康，朱科學(xué)，等.茶葉蛋白質(zhì)對面團流變學(xué)特性的影響[J].食品工業(yè)科技，2012（8）：146-149.

[9] 張曉暉，章克昌，活 潑，等.非水溶性茶蛋白的提取工藝研究[J].食品研究與開發(fā)，2005（3）：64-67.

[10] 朱建華，鄒秀容，陳俠濤.微波提取碎米蛋白質(zhì)的工藝研究[J].現(xiàn)代食品科技，2013（2）：294-296.

[11] 魏 群.基礎(chǔ)生物化學(xué)實驗[M].第三版.北京：高等教育出版社，2009.

[12] 蔡志寧，王春燕，梁翠金，等.茶渣蛋白提取工藝研究[J].茶葉科學(xué)，2008（4）：309-312.

[13] 李 娟.非水溶性茶葉蛋白質(zhì)提取及理化性質(zhì)研究[D].烏魯木齊：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

[14] 黃婉玉，曹 煒，李 菁，等.考馬斯亮藍(lán)法測定果汁中蛋白質(zhì)的含量[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2009（5）：160-162.

[15] 石 曉，浮吟梅.花生蛋白持水性研究[J].糧油加工，2006（9）：56-57，60.

[16] ANSHARULLAH，JAMES A H，COLIN F C.Application of carbohydrases in extracting protein from rice bran[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture，1997，74（2）：141-146.

[17] SHIH F F，DAIGLE K.Use of Enzymes for the separation of protein from rice flour[J]. Cereal Chemistry，1997，74（4）：437-441.

[18] 李巨秀，王柏玉.福林-酚比色法測定桑椹中總多酚[J].食品科學(xué)，2009，30（18）：292-295.

[19] 黃光榮，沈蓮清，王向陽，等.茶葉蛋白質(zhì)功能性質(zhì)及其在肉制品中的應(yīng)用研究[J].食品工程，2008（1）：42-45.