周艷琳等

摘要：為研究豌豆根瘤菌（Rhizobium leguminosarum）3841透性酶基因rl1568的作用，通過同源重組構(gòu)建了豌豆根瘤菌透性酶基因rl1568突變體。結(jié)果表明，rl1568基因突變不影響菌株在自生培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)，但該基因突變株對(duì)低濃度的氧化物十分敏感且生長(zhǎng)較差。熒光定量RT-PCR結(jié)果表明，H2O2不能誘導(dǎo)rl1568基因表達(dá)。植物盆栽試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)rl1568基因突變對(duì)根瘤菌共生固氮能力無影響。

關(guān)鍵詞：豌豆根瘤菌（Rhizobium leguminosarum）；透性酶；rl1568基因； 抗氧化；共生固氮

中圖分類號(hào)：Q936 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）18-4613-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.18.057

細(xì)胞膜作為細(xì)胞與細(xì)胞外環(huán)境之間的一種選擇性通透屏障，一方面能保障細(xì)胞對(duì)基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝取、代謝廢物的排除和細(xì)胞內(nèi)離子濃度的調(diào)節(jié)；另一方面使細(xì)胞維持相對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，因此物質(zhì)的跨膜運(yùn)輸對(duì)細(xì)胞的生存和生長(zhǎng)極為重要。跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過程大部分情況是由膜蛋白介導(dǎo)的，在功能上有時(shí)與細(xì)胞外受體和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的調(diào)控蛋白相聯(lián)系[1-3]，這種蛋白復(fù)合體可稱為轉(zhuǎn)運(yùn)體，或者透性酶。

根瘤菌是一類能夠以類菌體的形式存在于豆科植物中的革蘭氏陰性菌，一方面將氮?dú)夤潭ǔ芍参锼璧?；另一方面利用植物所提供的氮源生存。為建立這種共生系統(tǒng)，土壤中的根瘤菌必須在根系環(huán)境中大量繁殖，并與其他有機(jī)體爭(zhēng)奪養(yǎng)分，而根瘤菌中被發(fā)現(xiàn)越來越多的轉(zhuǎn)運(yùn)體為根瘤菌在根系定殖時(shí)獲得重要的養(yǎng)分如氨基酸[4]。在豌豆根瘤菌（Rhizobium leguminosarum）中，編碼氨基酸透性酶Aap和Bra基因雙突變后，由于不能利用谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸以及天冬氨酸等氨基酸，根瘤菌生長(zhǎng)受到明顯影響[5]。另外在肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）中發(fā)現(xiàn)作為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體的psa透性酶不僅參與Mn2+轉(zhuǎn)運(yùn)，同時(shí)在系統(tǒng)毒性和抵御超氧化物以及過氧化物中起重要作用[6]。

在豌豆根瘤菌中發(fā)現(xiàn)了一種透性酶基因rl1568（NC_008380.1），編碼一個(gè)362氨基酸的蛋白質(zhì)（YP_767172.1），含有6個(gè)跨膜區(qū)域，屬于YjgP/YjgQ超家族。YjgP/YjgQ超家族存在范圍廣泛，如單獨(dú)以膜結(jié)構(gòu)[7]存在，或者與其他結(jié)構(gòu)域構(gòu)成各種酶如組氨酸激酶[8]以及脂肪酶[9]，其功能推測(cè)為透性酶[10]，但具體功能機(jī)制尚不清楚。在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)屬于YjgP/YjgQ超家族的兩種內(nèi)膜蛋白YjgP和YjgQ在脂多糖LPS轉(zhuǎn)運(yùn)的過程中起重要作用，推測(cè)可能為ABC型轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的一部分[11]，而在Rhodopirellula baltica SH 1中則推測(cè)為信號(hào)肽[12]。因此本研究在構(gòu)建豌豆根瘤菌3841 rl1568基因突變株的基礎(chǔ)上，通過自生和共生試驗(yàn)，研究了rl1568基因是否對(duì)菌株生長(zhǎng)和共生固氮能力有影響，并通過RT-PCR分析相關(guān)基因的表達(dá)情況，為闡明rl1568基因的調(diào)控機(jī)制提供了研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種質(zhì)粒和培養(yǎng)基 豌豆根瘤菌3841和克隆載體pK19mob由英國(guó)牛津大學(xué)Philip S Poole教授提供。LB培養(yǎng)基[13]用于大腸桿菌培養(yǎng)，豌豆根瘤菌培養(yǎng)所用培養(yǎng)基TY[13]和AMS培養(yǎng)基[14]。培養(yǎng)根瘤菌所用抗生素：鏈霉素（Str）、新霉素（Neo）、卡那霉素（Km）和四環(huán)素（Tc），購(gòu)于Sigma公司，使用濃度為：Str，500 μg/mL；Neo，80 μg/mL；Tc，2 μg/mL；培養(yǎng)大腸桿菌所用抗生素濃度：Km，20 μg/mL； Tc，5 μg/mL。

1.1.2 主要試劑和儀器 限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ 及XbaⅠ，T4 DNA連接酶，RNAiso Plus等（TAKARA公司）；phusion 高保真酶、Taq DNA 聚合酶（Thermo scientific），DNA凝膠回收試劑盒（博大泰克生物技術(shù)有限公司），PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time），F(xiàn)astStart Universal SYBR Green Master （Roche），752型紫外可見光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司），PCR儀（Biometra），熒光定量PCR儀（Applied Biosystems）。

1.2 rl1568基因插入突變株的構(gòu)建

rl1568基因突變按照Luo等[15]方法進(jìn)行，以豌豆根瘤菌3841總DNA為模板，以Pr1568-1F/Pr1568-1R為引物擴(kuò)增得到目的片段，引物見表1。將擴(kuò)增得到的產(chǎn)物與空載體pK19mob分別經(jīng)XbaⅠ和Hind Ⅲ雙酶切后，利用T4 DNA連接酶連接過夜，然后導(dǎo)入DH5α中，經(jīng)PCR和測(cè)序驗(yàn)證后，獲得陽(yáng)性克隆質(zhì)粒pK1568。以含pK1568質(zhì)粒的大腸桿菌為供體菌，3841為受體菌，含質(zhì)粒pRK2013的大腸桿菌為輔助菌進(jìn)行三親本雜交，通過抗性篩選及用引物Pr1568-map/M13F PCR驗(yàn)證缺失突變株。

1.3 菌株生長(zhǎng)情況

1.3.1 無H2O2脅迫條件下菌株的生長(zhǎng)情況 將已活化的RL1568和3841經(jīng)AMS洗脫后，接種于50 mL的AMS培養(yǎng)基中，使初始OD600 nm為0.01，每個(gè)菌3個(gè)重復(fù)，28 ℃下200 r/min于搖床中振蕩培養(yǎng)，每隔一段時(shí)間取樣，測(cè)定OD600 nm。

1.3.2 抑菌圈試驗(yàn) 將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的待測(cè)菌株經(jīng)生理鹽水清洗并重新溶解后，涂布于AMS瓊脂平板，待平板晾干后將浸有不同濃度氧化物的圓濾紙片放置在平板中央，每個(gè)平板一個(gè)圓濾紙片，每種濃度3個(gè)重復(fù)，測(cè)定抑菌圈的直徑。氧化物為過氧化氫（H2O2）和過氧化氫異丙苯（CuOOH），其中CuOOH用無水乙醇稀釋成不同濃度。endprint

1.4 qRT-PCR分析相關(guān)抗氧化基因的表達(dá)量

進(jìn)行細(xì)菌RNA提取[16]時(shí)，將3841接種于AMS液體培養(yǎng)基中，使初始OD600 nm為0.01，28 ℃下200 r/min于搖床中振蕩培養(yǎng)至OD600 nm在0.3至0.6之間，菌體離心收集后分別用生理鹽水和0.5 mmol/L H2O2處理1 h，采用Trizol法提取總RNA，然后利用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用相關(guān)抗氧化基因的PCR引物和gyrB1內(nèi)參基因的引物（表1），對(duì)cDNA模板進(jìn)行熒光定量PCR。

1.5 植物盆栽試驗(yàn)

參照Poole等[17]的方法，采用無菌蛭石盆栽。豌豆種子經(jīng)表面滅菌催芽處理后，播入已滅菌的蛭石塑料燒杯。栽培大豆用無氮營(yíng)養(yǎng)液，播種時(shí)每顆豌豆上加1 mL相應(yīng)菌液，一缽2豌豆，3缽重復(fù)。蓋好保鮮膜后放入光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3周后利用乙炔還原法測(cè)量根瘤固氮酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 豌豆根瘤菌3841 rl1568基因突變體的構(gòu)建

參照Karunakaran等[18]突變體構(gòu)建的方法，利用Pr1568-map/pk19A對(duì)重組子進(jìn)行PCR驗(yàn)證，成功擴(kuò)增出1 kb左右的目標(biāo)片段（圖1），獲得rl1568基因突變株RL1568。

2.2 rl1568基因突變后豌豆根瘤菌對(duì)H2O2敏感

2.2.1 rl1568基因突變不影響菌株正常生長(zhǎng) 將RL1568和3841分別接種于AMS培養(yǎng)基上，使初始OD600 nm為0.1，每隔一段時(shí)間測(cè)定其OD600 nm。結(jié)果（圖2）表明，突變株RL1568的生長(zhǎng)情況與野生型3841無明顯區(qū)別，表明rl1568基因?qū)ν愣垢鼍?841生長(zhǎng)無明顯影響。

2.2.2 rl1568基因突變影響豌豆根瘤菌抗氧化能力 選取H2O2和CuOOH作為過氧化物，研究了不同濃度下野生型3841和突變株RL1568的抑菌圈直徑（表2）。當(dāng)H2O2以及CuOOH濃度在100 mmol/L和50 mmol/L時(shí)，培養(yǎng)24 h后，突變株抑菌圈直徑相對(duì)于野生型3841很大，有顯著性差異；而在高濃度情況下兩者相差不大。表明rl1568基因?qū)Φ蜐舛鹊腍2O2和CuOOH更為敏感。

2.3 抗氧化相關(guān)基因的表達(dá)分析

進(jìn)行RT-PCR后，并用2-ΔΔCt進(jìn)行處理，以生理鹽水處理的3841為對(duì)照，0.5 mmol/L H2O2處理的3841中rl1568基因的表達(dá)量為0.98±0.5，表明rl1568基因表達(dá)不受H2O2的影響。

2.4 植物盆栽試驗(yàn)

將突變株RL1568和野生型3841接種于豌豆中4周后，突變株RL1568接種的植株能形成粉紅色有效根瘤，用乙炔還原法測(cè)定豌豆植株的固氮酶活。結(jié)果表明，野生型3841的固氮酶活為3.58±0.44 μmol/（g·h），RL1568為3.39±1.19 μmol/（g·h），兩者固氮酶活無明顯差異，表明rl1568基因突變對(duì)根瘤固氮無明顯影響（圖3）。

3 小結(jié)與討論

細(xì)胞膜的外膜結(jié)構(gòu)OM作為一種選擇性透性屏障阻擋有毒物質(zhì)比如去污劑和抗生素[19]。根瘤菌與豆科植物共生固氮中，根瘤菌分泌的外膜蛋白對(duì)根毛的吸附、根瘤及侵染結(jié)構(gòu)的形成、保護(hù)細(xì)胞免受植物防衛(wèi)反應(yīng)的作用等方面都有重要作用[20]。

在本試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)透性酶rl1568基因突變雖然對(duì)豌豆根瘤菌3841正常生長(zhǎng)并無明顯影響，但對(duì)低濃度的氧化物如H2O2和CuOOH敏感。在低濃度的氧化物濃度下，突變株RL1568的抑菌圈直徑比野生型3841明顯大很多，但當(dāng)氧化物濃度提高時(shí)，兩者并無明顯差別。經(jīng)H2O2處理后，野生型菌株中rl1568基因表達(dá)量為0.98±0.5，說明rl1568基因表達(dá)并不受外界H2O2影響。此外通過盆栽試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，rl1568基因突變并不影響豌豆根瘤菌的固氮能力。rl1568基因編碼產(chǎn)物屬于YjgP/YjgQ透性酶，目前還沒有關(guān)于YjgP/YjgQ透性酶抗氧化相關(guān)的報(bào)道，對(duì)rl1568基因及YjgP/YjgQ透性酶在抗氧化中的機(jī)制還有待深入研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] HIGGINS C F.The ABC of channel regulation[J].Cell，1995， 82（5）：693-696.

[2] REIZER J， SAIER J M H. Modular multidomain phosphoryl transfer proteins of bacteria[J]. Current Opinion in Structural Biology，1997，7（3）：407-415.

[3] SAURIN W， HOFNUNG M， DASSA E. Getting in or out： Early segregation between importers and exporters in the evolution of ATP-binding cassette （ABC） transporters[J]. Journal of Molecular Evolution， 1999， 48（1）： 22-41.

[4] HOSIE A H F， ALLAWAY D， POOLE P S. A monocarboxylate permease of Rhizobium leguminosarum is the first member of a new subfamily of transporters[J]. Journal of Bacteriology， 2002， 184（19）： 5436-5448.endprint

[5] MCALLISTER L J，TSENG H J，OGUNNIYI A D，et al. Molecular analysis of the psa permease complex of Streptococcus pneumoniae[J]. Molecular Microbiology，2004，53（3）：889-901.

[6] HOSIE A H F，ALLAWAY D，GALLOWAY C S，et al. Rhizobium leguminosarum has a second general amino acid permease with unusually broad substrate specificity and high similarity to branched-chain amino acid transporters （Bra/LIV） of the ABC family[J]. Journal of Bacteriology，2002，184（15）：4071-4080.

[7] KANEKO T，SATO S，KOTANI H，et al. Sequence analysis of the genome of the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC6803.Ⅱ. Sequence determination of the entire genome and assignment of potential protein-coding regions[J]. DNA Research，1996，3（3）：109-136.

[8] THOMSON N R， HOWARD S， WREN B W， et al. The complete genome sequence and comparative genome analysis of the high pathogenicity Yersinia enterocolitica strain 8081[J]. PLoS Genetics，2006，2（12）：e206.

[9] WANG Y， LI X， MAO Y， et al. Genome-wide dynamic transcriptional profiling in Clostridium beijerinckii NCIMB 8052 using single-nucleotide resolution RNA-Seq[J]. BMC Genomics， 2012， 13（1）： 102-117.

[10] FINN R D， MISTRY J， SCHUSTER-B？魻CKLER B， et al. Pfam： Clans， web tools and services[J]. Nucleic Acids Research， 2006， 34（s1）： 247-251.

[11] RUIZ N， GRONENBERG L S， KAHNE D， et al. Identification of two inner-membrane proteins required for the transport of lipopolysaccharide to the outer membrane of Escherichia coli[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2008， 105（14）： 5537-5542.

[12] GL？魻CKNER F O，KUBE M，BAUER M，et al.Complete genome sequence of the marine planctomycete Pirellula sp. strain 1[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，2003， 100（14）： 8298-8303.

[13] JOSEPH S， DAVID W R，HUANG P. Molecular Cloning-A Laboratory Manual[M].Beijing： Science Press，2002.

[14] WHITTENBURY R， PHILLIPS K C，WILKINSON J F. Enrichment， isolation and some properties of methane-utilizing bacteria[J]. Journal of General Microbiology， 1970， 61（2）： 205-218.

[15] LUO L，YAO S，BECKER A，et al.Two new Sinorhizobium meliloti LysR-type transcriptional regulators required for nodulation[J].Journal of Bacteriology，2005，187（13）： 4562-4572.

[16] 彭杰麗.基于全局轉(zhuǎn)錄組分析研究華癸中慢生根瘤菌7653R 類菌體分化和固氮機(jī)理[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

[17] POOLE P S，BLYTH A，REID C J，et al. Myo-Inositol catabolism and catabolite regulation in Rhizobium leguminosarum bv. Viciae[J]. Microbiology， 1994， 140（10）： 2787-2795.

[18] KARUNAKARAN R， HAAG A F， EAST A K， et al. BacA is essential for bacteroid development in nodules of galegoid， but not phaseoloid， legumes[J]. Journal of Bacteriology， 2010， 192（11）： 2920-2928.

[19] NIKAIDO H. Molecular basis of bacterial outer membrane permeability revisited[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews， 2003， 67（4）： 593-656.

[20] 程國(guó)軍，周俊初，李友國(guó).華癸中生根瘤菌脂多糖突變株的共生能力[J].中南民族大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，27（2）：11-13.endprint