TDZ對尾細(xì)桉葉片離體再生的影響

范春節(jié)++王象軍++裘珍飛++曾炳山++劉英++李湘陽

摘 要 以尾細(xì)桉9個無性系葉片為外植體進行葉片離體培養(yǎng)和植株再生研究。結(jié)果表明，TDZ對尾細(xì)桉的再生誘導(dǎo)起著明顯的促進作用，9個尾細(xì)桉無性系都獲得了植株誘導(dǎo)再生，再生過程中不同的無性系呈現(xiàn)出不同的TDZ響應(yīng)濃度，TDZ濃度在0.005～0.010 mg/L時獲得較高的再生效率。不同無性系之間的再生率呈現(xiàn)出明顯的差異，其中無性系YL2獲得了最高達(dá)69.2%的植株再生效率，且每個外植體平均芽數(shù)超過10個。TDZ濃度對YL2的再生起到顯著性影響，0.050 mg/L時再生效率最高，可以進行下一步的遺傳轉(zhuǎn)化研究。

關(guān)鍵詞 尾細(xì)桉 ；葉片 ；植株再生 ；TDZ

分類號 S792

Effect of TDZ in Vitro Culture and Plant Regeneration from Leaves

of Eucalyptus urophylla×E. tereticornis Clones

FAN Chunjie WANG Xiangjun QIU Zhenfei

ZENG Bingshan LIU Ying LI Xiangyang

（Research Institute of Tropical Forestry， Chinese Academy of Forestry，

Guangzhou， Guangdong 510520， China）

Abstract In this study， leaves were applied as explants to establish a regeneration protocol for nine Eucalyptus urophylla×E. tereticornis clones. The results showed that all nine clones tested were amenable to improve production using modified MS media containing TDZ. Differences in TDZ concentrations requirements for organogenesis were observed between different clones and shoots were induced at a high frequency with 0.005～0.010 mg/L TDZ. For E. urophylla×E. tereticornis clones YL2， shoot regeneration frequency was significantly effected by TDZ concentration. Up to 69.23% regenerating leaves provided with over 10 buds were obtained on modified MS medium containing 0.050 mg/L TDZ. The efficient plant regeneration system developed here will be helpful for further genetic improvement in E. urophylla ×E. tereticornis clone YL2.

Keywords Eucalyptus urophylla×E. tereticornis ； leaves ； shoot regeneration ； TDZ

桉樹起源于澳大利亞及附近島嶼，是桃金娘科（Myrtaceae）桉樹屬（Eucalyptus）的總稱，是一種集觀賞、用材、紙漿原料、藥用于一體的優(yōu)良樹種。由于桉樹具有速生豐產(chǎn)、適應(yīng)性廣等特點，在熱帶和亞熱帶地區(qū)有廣泛的栽培，是華南地區(qū)第一大造林樹種[1]。近年來，由于轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得桉樹抗蟲、抗旱、抗寒優(yōu)良特征的新品種是植物育種的重要途徑之一[2]。然而，轉(zhuǎn)基因體系依賴于高效穩(wěn)定的再生體系，具有高效穩(wěn)定再生率的再生體系成為發(fā)展桉樹轉(zhuǎn)基因技術(shù)的一大難題。

桉樹再生體系建立已經(jīng)有多個報道，在早期的研究中主要以來源雨桉樹種子苗的下胚軸、子葉等有性材料作為外植體材料進行植株再生研究，赤桉（E. camaldulensis）、巨桉（E. grandis）、藍(lán)桉（E.globulus）、尾葉桉（E. urophylla）等多個桉樹的再生體系已經(jīng)建立[3-5]。由于目前桉樹種植和栽培已經(jīng)無性系化，這些以有性材料為基礎(chǔ)建立的再生體系難以進行真正的轉(zhuǎn)基因育種。近年來，研究者逐漸開展了以桉樹無性系的組培苗離體葉片或莖段為外植體進行再生體系建立研究，獲得了巨桉EG5、尾赤桉（E. urophylla×E. camaldulensis）DH201-2、尾巨桉（E. urophylla×E. grandis）DH3229等無性系的再生體系[6-9]，為桉樹進一步的轉(zhuǎn)基因育種奠定基礎(chǔ)。盡管如此，以尾細(xì)桉葉片或莖段為外植體的再生體系尚未建立。

尾細(xì)桉（Eucalyptus urophylla×E. tereticornis）是尾葉桉與細(xì)葉桉的雜交種，綜合了父本和母本的優(yōu)良速生、制漿得率高、抗風(fēng)能力強等優(yōu)點。廣泛種植于廣東、廣西、海南、福建等省區(qū)，經(jīng)國營雷州林業(yè)局多年生長測定已成為臺風(fēng)多發(fā)地區(qū)造林首選樹種[10]。目前尾細(xì)桉的組織培養(yǎng)體系和扦插體系已完全建立[11-12]，但尾細(xì)桉的葉片離體再生研究尚未開展。噻二唑苯基脲（thidiazuron， TDZ）作為一種植物生長調(diào)節(jié)劑，有很強的細(xì)胞分裂素活性，在包括桉樹等多個植物再生研究中發(fā)現(xiàn)其具有較強的誘導(dǎo)再生能力[13-15]。本研究選擇TDZ對多個無性系進行葉片再生誘導(dǎo)研究，以期建立起尾細(xì)桉的再生體系，為尾細(xì)桉的轉(zhuǎn)基因研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

9個尾細(xì)桉無性系母本來源于印度尼西亞的MT Egon，父本來源于澳大利亞的40K N Gladstone，QLD，由中國林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所進行雜交獲得。試驗所用材料全部采用在生根培養(yǎng)基上生根培養(yǎng)25～30 d的無菌生根苗，選取完全展開的葉片作為外植體進行再生研究。

1.2 方法

1.2.1 再生誘導(dǎo)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

再生誘導(dǎo)培養(yǎng)基以改良的MS培養(yǎng)基加入0.20 mg/L的6-BA為基本培養(yǎng)基；在所有的培養(yǎng)基中分別加入7.0 g/L的瓊脂和30.0 g/L的蔗糖。光照時間為16 h/8 h， 光照強度為1 500～2 000 lx， 培養(yǎng)溫度為（25±2）℃左右。

1.2.2 實驗設(shè)計

在再生誘導(dǎo)基本培養(yǎng)基上分別添加0.000、0.005、0.010、0.050、0.100、0.200 mg/L的TDZ（Thidiazuran），每個處理有40～60個葉片外植體，重復(fù)3次。

誘導(dǎo)的不定芽轉(zhuǎn)移到不定芽伸長培養(yǎng)基中進行芽伸長培養(yǎng)，15～20 d轉(zhuǎn)接1次。選擇2～3 cm的不定芽轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中進行生根誘導(dǎo)培養(yǎng)。

1.2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

外植體在培養(yǎng)基上培養(yǎng)45 d后，調(diào)查愈傷組織誘導(dǎo)率、芽再生率、平均再生率、平均再生芽數(shù)、芽狀態(tài)、愈傷組織大小和愈傷顏色等指標(biāo)。其中愈傷組織的大小分為4種：愈傷組織的直徑不超過葉片切面直徑2倍的為1；2～4倍時為2；4～10倍以上的為3；超過10倍以上的為4。 愈傷組織誘導(dǎo)率（%）=產(chǎn)生愈傷組織的外植體數(shù)/總外植體數(shù)×100%；芽再生率（%）=產(chǎn)生芽的外植體數(shù)/總外植體數(shù)×100%；平均再生率為一個無性系所有處理下的再生率；平均再生芽數(shù)=外植體不定芽總數(shù)/產(chǎn)生不定芽外植體個數(shù)。數(shù)據(jù)分析采用SPSS18.0進行分析，顯著性分析采用LSD法，α≤0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同無性系葉片再生差異

通過對尾細(xì)桉9個無性系進行葉片再生誘導(dǎo)，對所有處理的平均芽再生率和愈傷組織再生率等進行統(tǒng)計。結(jié)果表明：不同的無性系之間的芽再生率存在著顯著性差異，其中YL2、YL16在不同濃度的TDZ誘導(dǎo)下均能夠再生出芽，其平均再生率超過10.0%，其中無性系YL2的平均再生率達(dá)到33.2%（如圖1），其他大多數(shù)無性系植株再生誘導(dǎo)率均低于10.0%，其中無性系YL5在所有的處理中沒有得到或極少得到再生植株。通過對不同無性系的愈傷組織調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在所有的無性系中都獲得了較高的愈傷組織誘導(dǎo)率，除偶爾個別葉片出現(xiàn)死亡沒有愈傷組織出現(xiàn)外，幾乎所有的葉片都能夠誘導(dǎo)出愈傷組織，但不同無性系愈傷組織形態(tài)和顏色均出現(xiàn)較大差異，如YL2、YL13、YL16誘導(dǎo)的愈傷組織較致密且呈現(xiàn)出黃綠色，個別出現(xiàn)紅黃色。而YL5、YL7誘導(dǎo)的愈傷組織松散，在早期是灰白色，且容易發(fā)生褐變。這些說明再生率與愈傷組織形態(tài)和愈傷組織顏色有一定的關(guān)系。

2.2 不同TDZ濃度對葉片再生影響

通過對不同TDZ濃度對尾細(xì)桉無性系再生誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn)，除了YL5，不同濃度的TDZ的添加都能促進尾細(xì)桉的葉片再生。在不同的無性系之間，TDZ對芽再生率呈現(xiàn)出顯著性差異。TDZ濃度為0.005 mg/L時，YL10、YL18獲得5.0%的再生率；添加0.010 mg/L TDZ時，YL8、YL16分別得到5.0%和20.0%的再生率；而YL2在0.050 mg/L時得到最高69.23%的芽再生率；對于無性系YL7、YL13、YL15，TDZ濃度在0.100 mg/L時，獲得較高的芽再生率，見表1。除此之外，TDZ濃度在0.200 mg/L時，所有的尾細(xì)桉無性系芽再生率較低甚至無法再生，且愈傷組織狀態(tài)松散，顏色呈灰白色，部分愈傷組織還出現(xiàn)玻璃化和褐變。這些結(jié)果說明對于尾細(xì)桉再生誘導(dǎo)中TDZ濃度不宜超過0.200 mg/L。盡管在所有的尾細(xì)桉無性系中都得到不同比例的植株再生誘導(dǎo)，但幾乎大多數(shù)尾細(xì)桉的再生效率低于30.0%。

在9個尾細(xì)桉無性系中，YL2無性系獲得了最高的芽再生率，因此對YL2不同TDZ濃度下芽再生率、再生芽數(shù)、愈傷組織再生率、愈傷組織顏色、愈傷組織大小在進行進一步分析。不同TDZ濃度對芽再生率有顯著影響，隨著TDZ濃度的增加，芽再生率升高，在0.050 mg/L時達(dá)到最高誘導(dǎo)效率69.23%，同時發(fā)現(xiàn)在0.010和0.050 mg/L時愈傷組織的顏色呈現(xiàn)出黃綠色、愈傷致密，愈傷組織大小合適，且再生芽數(shù)較多，超過10個，且表現(xiàn)為多個再生位點。隨著TDZ濃度的進一步增加，在0.100和0.200 mg/L時，愈傷組織開始出現(xiàn)褐化，且有玻璃化現(xiàn)象出現(xiàn)，同時芽再生率和再生芽數(shù)也明顯減少。這些結(jié)果說明YL2葉片誘導(dǎo)再生時合適的TDZ濃度是0.010～0.050 mg/L，見表2。

2.3 YL2再生植株的伸長和生根誘導(dǎo)

將帶有多個芽點的愈傷組織轉(zhuǎn)移到再生植株伸長培養(yǎng)基上，芽苗生長狀態(tài)良好，20 d后大量的芽苗抽高。切取2～3 cm的芽轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中，14 d后獲得了85%以上的生根率，且生根苗生長狀態(tài)良好。

3 討論與結(jié)論

本研究選取多個無性系以TDZ為主要激素進行再生研究，在所有的無性系中，只有YL2在0.050 mg/L的TDZ中獲得了69.23%的再生率，而其他8個無性系再生率都在30.0%以下，證實了尾細(xì)桉的再生誘導(dǎo)存在著低再生率的問題。同時這些無性系的低再生率無法滿足接下來的尾細(xì)桉轉(zhuǎn)基因研究，需要進一步調(diào)整培養(yǎng)基或者外植體的生長狀態(tài)如生根時間等。同時也間接說明基因型對植株再生的影響，這在楊樹等木本植物中都得到了證實[16-17]。

TDZ作為一種有效的植株誘導(dǎo)再生植物生長調(diào)節(jié)劑，廣泛應(yīng)用于桉樹不同種以及其他物種的葉片外植體誘導(dǎo)植株再生[9-11]。在已建立的桉樹無性系再生體系中，大多都是以TDZ等為主要誘導(dǎo)激素對葉片或莖段進行植株再生誘導(dǎo)建立離體培養(yǎng)再生體系[4-5]。筆者在研究中曾使用KT和6BA作為主要的再生誘導(dǎo)激素進行再生植株誘導(dǎo)，除了偶爾有個別芽再生外，大多數(shù)處理不能誘導(dǎo)出再生植株，以TDZ作為再生激素誘導(dǎo)時獲得了較多的再生植株，證實了TDZ在桉樹葉片誘導(dǎo)芽再生體系建立中起著重要的作用。盡管如此，在尾細(xì)桉不同的無性系中的試驗表明，只有YL2無性系獲得了較高的再生率，說明TDZ并不是對所有的無性系起作用。在以巨桉和尾葉桉的雜種桉樹中發(fā)現(xiàn)，分別以噻唑基脲類新型分裂素（N-phenyl-N'-[6-（2-chlorobenzothiazol）-yl]urea，PBU）和吡效隆（1-（2-chloro-4-pyridyl）-3-phenylurea，CPPU）為主要的再生誘導(dǎo)生長調(diào)節(jié)劑獲得了91.3%和83.42%的再生誘導(dǎo)率[9，18]。因此，在下一步研究中，需要采用PBU或CPPU單獨或與TDZ結(jié)合進行葉片再生誘導(dǎo)試驗，研究其對尾細(xì)桉再生的影響。同時提示研究者在難以再生或低再生率的桉樹品種或無性系時，應(yīng)考慮PBU或CPPU等其他生長調(diào)節(jié)劑，可能獲得更好的效果。

致 謝 中國林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所甘四明研究員為本實驗提供了實驗材料和并且對實驗方案提出寶貴的意見，在此特別感謝。

參考文獻

[1] 謝耀堅.中國桉樹育種研究進展及宏觀策略[J]. 世界林業(yè)研究，2011，24（4）：50-54.

[2] 施季森.迎接 21 世紀(jì)現(xiàn)代林木生物技術(shù)育種的挑戰(zhàn)[J]. 南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2000，2（1）：1-6.

[3] 范春節(jié)，曾炳山，裘珍飛，等.桉樹轉(zhuǎn)基因研究進展[J]. 浙江林業(yè)科技，2008，28（2）：65-72.

[4] Matsunaga E， Nanto K， Oishi M， et al. Agrobacterium-mediated transformation of Eucalyptus globulus using explants with shoot apex with introduction of bacterial choline oxidase gene to enhance salt tolerance[J]. Plant Cell Reports， 2012， 31（1）：225-235.

[5] Ahad A， Maqbool A， Malik K A. Optimization of agrobacterium tumefaciens mediated transformation in Eucalyptus camaldulensis[J]. Pakistan Journal of Botany， 2014， 46（2）：735-740.

[6] 鄧 藝，曾炳山，劉 英，等. 巨桉無性系 EG5 葉片高效再生體系的建立[J]. 林業(yè)科學(xué)研究，2012，25（3）：394-399.

[7] 裘珍飛，曾炳山，李湘陽，等. 4 個桉樹無性系愈傷誘導(dǎo)和分化[J]. 林業(yè)科學(xué)研究，2012，25（4）：531-534.

[8] 范春節(jié)，曾炳山，裘珍飛，等. 尾赤桉葉片及莖段的離體培養(yǎng)與植株再生[J]. 福建林學(xué)院學(xué)報，2009，29（1）：74-78.

[9] 孫長斌，郭 棣，張?zhí)m英. 尾巨桉愈傷組織誘導(dǎo)與再生體系的建立[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2013，31（6）：592-596.

[10] 彭仕堯，徐建民，李光友，等. 尾細(xì)桉無性系在雷州半島的生長與遺傳分析[J]. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報，2013，33（4）：23-27.

[11] 甘四明，李 梅，李發(fā)根，等.尾葉桉×細(xì)葉桉雜種無性系扦插生根和生長性狀的研究[J]. 林業(yè)科學(xué)研究，2006，19（2）：135-140.

[12] 劉奕清，王大平. 尾細(xì)桉的組織培養(yǎng)和快速繁殖[J]. 西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2005，27（2）：237-239.

[13] Roy A， Sajeev S， Pattanayak A， et al.TDZ induced micropropagation in Cymbidium giganteum Wall. Ex Lindl. and assessment of genetic variation in the regenerated plants[J]. Plant Growth Regulation，2012， 68（3）： 435-445.

[14] Bettencourt G， Oliveira C， Buss S， et al. In vitro organogenesis of Eucalyptus urophylla×E. grandis in three culture media[C].Guarujá：Congresso Brasileiro de Biotechnologia，2013.

[15] Degenhardt-Goldbach J， Quoirin M， Buss S， et al. In vitro shoot organogenesis from Eucalyptus sp. leaf explants[J].Bio Med Central Ltd， 2011， （5）： 134.

[16] 崔旭東，蘇曉華，張冰玉，等. 歐美楊渤豐1號高效組培再生體系建立[J]. 林業(yè)科學(xué)研究，2012，25（2）：157-162.

[17] 沈周高，項 艷，蔡 誠，等. 3個楊樹品種葉片再生體系的建立[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，2006，22（11）：90-96.

[18] Ouyang L， Huang Z， Zhao L， et al. Efficient regeneration of Eucalyptus urophylla×Eucalyptus grandis from stem segment. Brazilian Archives of Biology and Technology， 2012， 55（3）： 329-334.