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      大腸桿菌中重組尖吻蝮蛇類凝血酶的純化及鑒定

      2015-10-15 19:47:25程欲劉樹滔饒平凡
      科技資訊 2015年20期
      關(guān)鍵詞:純化鑒定

      程欲+++劉樹滔++饒平凡

      摘要:尖吻蝮蛇類凝血酶直接裂解纖維蛋白原且不激活凝血因子表現(xiàn)出良好抗凝效應(yīng),是重要的血栓類藥物。大腸桿菌中高效表達(dá)重組尖吻蝮蛇類凝血酶,通過陰離子層析(DEAE650M,0.02M PBS+0.2M NaCl洗脫)和親和層析(鎳柱,0.02M PBS+0.5M NaCl溶液+20mM咪唑溶液洗脫),獲得較純樣品。利用腸激酶酶切、纖維蛋白凝結(jié)活性、免疫印跡方式鑒定純化樣品為活性目的蛋白。此結(jié)果為商品化生產(chǎn)、應(yīng)用類凝血酶提供思路及方向。

      關(guān)鍵詞:類凝血酶 純化 鑒定

      中圖分類號(hào):G64 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1672-3791(2015)07(b)-0000-00

      類凝血酶(thrombin-like enzyme)是一種絲氨酸蛋白酶[1-2],作用于纖維蛋白原,使其產(chǎn)生側(cè)鏈不交聯(lián)的片段。該片段易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬或正常纖溶作用清除[3-4],而不激活凝血因子,具有重要醫(yī)藥價(jià)值。受限于天然活體來源及復(fù)雜的復(fù)雜純化條件,蛇毒類凝血酶在血栓類藥物研發(fā)中難以突破[5]。本文利用工程菌構(gòu)建、表達(dá)出尖吻蝮蛇類凝血酶,研究其純化條件,鑒定其純化效果,以期大量、高效獲得活性蛋白,應(yīng)用于商品化生產(chǎn)、利用。

      1 材料與方法

      1.1菌株

      穩(wěn)定表達(dá)尖吻蝮蛇類凝血酶菌株(Rosetta-pET32a-acutobin)由福州大學(xué)生物工程研究所保存。

      1.2試劑與儀器

      離子交換樹脂填料DEAE650M、親和層析組氨酸填料(His鎳柱)保藏于福州大學(xué)生物工程研究所;重組腸激酶(EK酶)購于invitrogen公司產(chǎn)品;牛纖維蛋白原購于Sigma公司;其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

      蛋白純化系統(tǒng)及恒壓恒流電泳儀購于東方特力科貿(mào)中心;Mini PROTEIN II電泳槽購于美國(guó)BIO-RAD公司。

      1.3重組類凝血酶表達(dá)

      穩(wěn)定表達(dá)尖吻蝮蛇類凝血酶菌株(Rosetta-pET32a-acutobin)于LB+培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基添加有氨芐青霉素),30℃,誘導(dǎo)劑IPTG濃度為0.5 mmol·L-1條件下培養(yǎng)3h[6],獲取重組蛋白.。

      1.4重組類凝血酶純化

      1.4.1陰離子層析——DEAE650M

      綜合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,將重組菌破碎液通過陰離子層析柱(DEAE650M),通過添加0.1M、0.2M、0.3M、0.5M和0.7M NaCl的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液(PBS緩沖液)階梯洗脫,收集峰樣用紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD280,并記錄數(shù)據(jù)、繪制曲線圖譜,以此獲得初步純化樣品,-20℃保藏備用. 。

      全過程中使用緩沖液如表1所示。

      試劑 組成

      平衡緩沖液 20mM PBS(pH7.5)

      洗脫緩沖液 20mM PBS(含不同濃度NaCl)

      1.4.2親和層析——鎳柱

      利用重組融合蛋白表達(dá)標(biāo)簽(六個(gè)His殘基序列)能夠與二價(jià)金屬離子(如鎳、鋅等)螯合,達(dá)到特異性吸附、分離功效。將陰離子層析收集含有目的蛋白樣品,通過鎳柱親和層析再次純化,全過程使用緩沖液如表2所示。樣品經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD280,記錄數(shù)據(jù)并繪制曲線圖譜,收集純化樣品,-20℃保藏備用。

      試劑 組成

      鎳柱活化緩沖液 0.1M NiSO4緩沖液

      平衡緩沖液 20mM PBS(pH8.0)

      洗脫緩沖液 20mM PBS(含不同濃度咪唑、0.5M NaCl)

      1.5重組類凝血酶鑒定

      1.5.1 SDS-PAGE

      采用不連續(xù)凝膠檢測(cè),分離膠濃度12.5%,蛋白條帶用考馬斯亮藍(lán)染色[7]。

      1.5.2纖維蛋白凝結(jié)活性

      1mg· mL-1的純化產(chǎn)物與9mg·mL-1的牛纖維蛋白原(均溶解于Tris-HCl緩沖溶液,pH7.0,)37℃孵育1h,觀察凝結(jié)現(xiàn)象。同時(shí)以純水、牛纖維蛋白代替目標(biāo)蛋白作對(duì)照組[8-9]。

      1.5.3腸激酶酶切

      pET32a載體在融合硫還原蛋白與自身蛋白間存在腸激酶酶切位點(diǎn)。取純化樣品100μl加入1U腸激酶,輕混后37℃溫浴2h,利用腸激酶酶切特性,將融合蛋白酶分成兩個(gè)片段,而后通過SDS-PAGE電泳對(duì)片段分子量測(cè)定,初步驗(yàn)證重組融合蛋白。實(shí)驗(yàn)以純水代替腸激酶作為空白對(duì)照組。

      1.5.4免疫印跡

      純化樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后割下相應(yīng)凝膠,利用電轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜(電泳-割膠-轉(zhuǎn)膜);而后轉(zhuǎn)移至封閉液中,室溫下振搖1h(免疫:封閉);取出、吸凈殘液,將蛋白面浸沒于一抗液,室溫孵育1h,而后用TBST室溫下振搖兩次,每次10min,再用TBS室溫下振搖10min(免疫:一抗反應(yīng));取出、吸凈殘液,用二抗液室溫孵育1-2h,而后再用TBST室溫下振搖兩次,每次10min,TBS室溫下振搖10min,取出進(jìn)行顯色(免疫:二抗反應(yīng)).)。

      2 結(jié)論

      2.1重組類凝血酶純化

      2.1.1陰離子層析——DEAE650M

      誘導(dǎo)表達(dá)后菌體經(jīng)超聲波破碎、高速離心,結(jié)果顯示目的蛋白大部分存在于上清液(前期預(yù)實(shí)驗(yàn)已驗(yàn)證),為可溶性蛋白。根據(jù)蛋白質(zhì)間理化性質(zhì)差異,經(jīng)不同鹽溶液階梯洗脫,檢測(cè)OD280,收集峰樣,繪制曲線,如圖1所示。為判定收集樣品中蛋白分布,經(jīng)SDS-PAGE檢驗(yàn),如圖2所示。

      通過ExPASy-Compute pI/Mw計(jì)算可知,尖吻蝮蛇類凝血酶理論分子質(zhì)量為44.3kDa,對(duì)比電泳圖譜可知0.02M PBS+0.2M NaCl洗脫條件下得到主要目的蛋白樣品(D2),收集此峰樣用于再次純化 。

      2.1.2親和層析——鎳柱

      粗純化類凝血酶樣品(D2)通過鎳柱親和層析,在不同咪唑濃度條件下階梯洗脫,收集樣品,檢測(cè)OD280繪制曲線,如圖3所示。獲得峰樣,通過SDS-PAGE檢測(cè),如圖4所示。 電泳圖譜中N2樣品(0.02M PBS+0.5M NaCl溶液+20mM咪唑溶液洗脫)在目的蛋白理論分子量處存在較為單一條帶,推斷經(jīng)過兩步操作,可獲得較純尖吻蝮蛇類凝血酶樣品。

      2.2重組類凝血酶驗(yàn)證

      2.2.1腸激酶酶切

      表達(dá)蛋白樣品與腸激酶在37℃條件下反應(yīng)1h,利用SDS-PAGE檢測(cè),如圖5所示。融合蛋白被剪切為分子量18kDa和26kDa兩部分,且目的蛋白處存在明顯因剪切而減少的痕跡,此現(xiàn)象與預(yù)期構(gòu)建結(jié)果相契合。一定程度上表明,表達(dá)蛋白即尖吻蝮蛇類凝血酶(Rosetta-pET32-acutobin)。

      2.2.2纖維蛋白凝結(jié)活性

      利用試管法[8-9]處理樣品,如圖6所示 。陰性實(shí)驗(yàn)組(空白對(duì)照組,超純水)樣品呈現(xiàn)澄清透明狀液體,陽性實(shí)驗(yàn)組(牛凝血酶)呈現(xiàn)明顯渾濁膠狀,樣品組(純化目標(biāo)蛋白)呈現(xiàn)與陽性實(shí)驗(yàn)組相似渾濁膠狀。

      結(jié)果表明,重組蛋白pET32a-acutobin對(duì)牛纖維蛋白原具有特異酶活性,能使其出現(xiàn)白色渾濁狀態(tài),但無法真正形成凝固。其凝結(jié)效果與天然類凝血酶活性間仍存在差距。

      2.2.3免疫印跡(Western blotting)

      經(jīng)過兩步純化后樣品,借助His標(biāo)簽抗體進(jìn)行免疫印跡反應(yīng),結(jié)果如圖7所示。N2樣品條帶均是帶有His標(biāo)簽的相關(guān)蛋白質(zhì),推斷理論分子量處條帶為類凝血酶pET32a-acutobin,其余條帶可能為多個(gè)目的蛋白集合體(上端)和目的蛋白分離體(下端).。

      3 結(jié)語

      綜上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,利用工程菌重組表達(dá)類凝血酶,經(jīng)純化應(yīng)用于實(shí)際生活的思路是可行且有成效的。依托工程菌的高效表達(dá),以較低的環(huán)境代價(jià)為前提可獲得大量用于醫(yī)療的血栓類藥物,解決了直接由活體動(dòng)物提取的道德問題、提取量少、純化不易等瓶頸問題。通過簡(jiǎn)單的兩步純化,能夠很好的排除雜質(zhì)干擾,得到較為單一且具有活性的目的蛋白,既優(yōu)化工藝又節(jié)省成本。然而,酶活力驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)目前純化后重組蛋白的活力相較于成熟商品化產(chǎn)品仍存在差異。然而,酶活力驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)目前純化后重組蛋白的活力相較于成熟商品化產(chǎn)品仍存在差異。

      重組類凝血酶(Rosetta-pET32-acutobin)要正式推向市場(chǎng),現(xiàn)階段仍需解決酶活力提升[10]、保存問題,熱源性、致敏性物質(zhì)去除問題等 。同時(shí),相較于原核體系大腸桿菌胞內(nèi)表達(dá)的類凝血酶,可利用重組手段構(gòu)建胞外分泌真核體系目的蛋白從純化及適用性角度提升其整體價(jià)值。

      參考文獻(xiàn)

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      [3]任予斌,張向東,劉海鳳.降纖酶治療視網(wǎng)膜動(dòng)脈阻塞的臨床研究.眼科新進(jìn)展,2005,25(4):356-357.

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      [5]李家祺,李謙,唐松山,等.蛇毒類凝血酶基因工程的研究進(jìn)展[J].藥物生物技術(shù),2013,20(2):167-170.

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      [8]袁盛凌,王芃,陶好霞.蛇毒類凝血酶calobin在畢赤酵母中的表達(dá).生物工程學(xué)報(bào),2009, 25(4):526-532.

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