劉鴻昊，徐秋亞，劉 超*

（鄭州大學第一附屬醫(yī)院心血管外科；河南省高等學校臨床醫(yī)學重點學科開放實驗室，河南　鄭州　450052）

?基礎研究?

血管平滑肌細胞鈣化后轉化類型的研究

劉鴻昊，徐秋亞，劉 超*

（鄭州大學第一附屬醫(yī)院心血管外科；河南省高等學校臨床醫(yī)學重點學科開放實驗室，河南鄭州450052）

目的 分析主動脈血管平滑肌細胞鈣化后細胞轉化類型。方法 將第4代細胞等量隨機分為實驗組和對照組，給予實驗組10 mmol/L的β-甘油磷酸鹽進行細胞誘導，給予對照組正常DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)10天，測定兩組堿性磷酸酶（ALP）活性及骨鈣素的含量，采用Western blot方法檢測VSMCs及成骨細胞標志蛋白（骨橋蛋白）含量的差異。結果 細胞誘導鈣化后，細胞聚集并形成囊泡結構，實驗組ALP、骨鈣素含量較對照組有所增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；Western blot顯示成骨細胞標志物含量較對照組明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；骨橋蛋白（osteopontin，OPN）表達逐漸增強，對照組僅有微弱表達，且隨時間無明顯變化，實驗組OPN的表達明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論 主動脈血管平滑肌細胞在鈣化后會向成骨細胞轉化，可為血管鈣化通路、病因及治療提供新的思路和研究機制。

細胞鈣化；血管平滑肌細胞；鈣化模型；成骨細胞

如今心血管鈣化已成為普遍現(xiàn)象，許多心血管事件均與血管鈣化有關，如心肌梗死、瓣膜鈣化、夾層動脈瘤等疾病，這些疾病均有較高的致殘率和致死率。血管鈣化機制并沒有完全明確，普遍認為血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）對血管鈣化起著重要作用[1]，其作用機制及轉化分型對研究心血管疾病發(fā)病機制有著重要作用，因此對VSMCs鈣化后轉化類型研究有積極的意義。本研究中，對VSMCs進行體外培養(yǎng)并誘導鈣化，旨在探討主動脈VSMCs鈣化后細胞轉化類型，為血管鈣化的機制及通路研究提供重要基礎。

1　材料與方法

1.1主要材料及試劑

血管平滑肌原代細胞（廣州吉尼生物科技有限公司）；DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司）；胎牛血清、雙抗、胰酶（HyClone公司）；OPN單克隆抗體及過氧化物酶標記的抗鼠IgG（中杉金橋生物技術有限公司）；堿性磷酸酶檢測試劑盒、β-甘油磷酸鹽、茜素紅染色劑及其他試劑耗材（鄭州樂睿生物科技有限公司）。實驗主要依托單位河南省高等學校臨床醫(yī)學重點學科開放實驗室。

1.2方法

1.2.1VSMCs體外鈣化模型建立

原代血管平滑肌細胞置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，待細胞長滿培養(yǎng)瓶，底面積＞80%并形成致密細胞層后開始傳代。將傳至第4代的細胞等量隨機分為實驗組和對照組，給予實驗組10 mmol/L的β-甘油磷酸鹽進行細胞誘導培養(yǎng)，給予對照組正常DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，換液1次/2 d，連續(xù)培養(yǎng)10天。

1.2.2堿性磷酸酶（ALP）測定

細胞棄去培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗細胞3次，取六孔板，每孔加入500μl 0.1%Triton X-100（0.9% NaCl制備），4℃過夜，反復吹打使細胞破碎，收集于離心管中，1200r/min離心3 min，收取上清，按ALP檢測試劑盒操作測定ALP活性。

1.2.3骨鈣素含量測定

將兩組細胞分別接種于25 mL培養(yǎng)瓶中，換液1次/3 d，連續(xù)培養(yǎng)10天。留置實驗第0天和10天更換下來的細胞培養(yǎng)液，置-80℃保存。測量前先將500μL樣品干燥濃縮成粉狀，采用125I放射免疫法測量骨鈣素，具體方法按試劑盒說明進行。實驗重復2次。

1.2.4Western blot測定成骨細胞標志蛋白含量

收取兩組細胞，裂解后取上清液，測定蛋白濃度，進行濃度測定及定量后，95℃5 min變性，加入1/3體積的4×SDS上樣緩沖液，電轉移蛋白至硝酸纖維素膜膜上，5%無脂奶粉封閉，一抗為OPN單克隆抗體（1:500），孵育雜交過夜，洗膜后在過氧化物酶標記的抗鼠IgG中孵育1 h，漂洗后ECL顯色，曝光，掃描并分析。獨立實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件對數據進行處理，計量資料以“±s”表示，采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結 果

2.1細胞鈣化

經β-甘油磷酸鹽誘導鈣化后可見實驗組大量鈣化結節(jié)，茜素紅染色后鈣化細胞呈紅色，并分布于整個細胞，對照組沒有附著紅色染料，實驗組細胞在鈣化誘導條件下有鈣鹽沉積，VSMCs鈣化模型建立成功。

2.2ALP檢測

兩組ALP活性均隨培養(yǎng)時間延長逐漸升高。實驗組ALP第10天明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1　兩組ALP活性的變化（，n=8）

2.3骨鈣素含量

對照組中骨鈣素含量很低，而實驗組細胞骨鈣素含量持續(xù)升高，且明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2　兩組細胞培養(yǎng)液上清骨鈣素含量變化（，n=8）

2.4成骨細胞標志物含量

Western blot顯示，實驗組OPN表達量明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖1　兩組細胞OPN表達，*P＜0.05

3 討 論

血管鈣化是一個與骨調節(jié)相關蛋白有關的主動調節(jié)過程，與臨床心血管疾病的發(fā)生密切相關，課題組在前期查閱文獻后綜述示鈣化的形式類似于軟骨內成骨和膜內成骨；同時中膜自身的血管平滑肌細胞具有向成骨細胞轉化的潛能[2]。本研究在上述結果的基礎上，通過血管平滑肌體外細胞鈣化模型，研究細胞鈣化轉化類型，為心血管疾病認識提供新的思路和研究機制。

本實驗中細胞活性及其純度是鈣化誘導成功的關鍵[3]。我們采用10 mmol/L β-甘油磷酸鹽作為誘導劑，β-甘油磷酸鹽能在短期內誘導血管平滑肌細胞彌漫性鈣化，與體內血管鈣化形式非常接近，β-甘油磷酸鹽是ALP的一種作用底物，在ALP的作用下分解產生無機磷酸鹽并以囊泡的形式分泌到胞外，與胞外基質相互作用，形成鈣化點；而10 mmol/L β-甘油磷酸鹽能上調血管平滑肌細胞的ALP水平，促進鈣化[1]。而對鈣化的鑒定采用茜素紅染色，茜素紅能夠螫合鈣鹽，使鈣化細胞呈現(xiàn)紅色或者橘紅色。

研究發(fā)現(xiàn)，鈣化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)是VSMCs向成骨樣細胞的轉分化，VSMCs在誘導條件下（如炎性因子、TGF-β和高密度脂蛋白等）均可轉變?yōu)榫哂泻铣珊头置诠δ艿某晒羌毎?，能合成和分泌多種骨形成蛋白，從而發(fā)生鈣化[4]。實驗組中成骨細胞標志物的ALP、OPN、骨鈣素含量在鈣化后含量明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表明鈣化過程中出現(xiàn)細胞類型變化—VSMCs向成骨樣細胞轉化。其中ALP是一個成骨過程中的關鍵酶，是反應成骨細胞成熟的標志性酶，其活性越高則提示成骨細胞的分化能力越強[5]；骨鈣素是體內最豐富的非膠原類骨基質蛋白，是骨細胞成熟的晚期標志之一，也是表示成骨細胞活性的一種特殊蛋白質[1]，ALP和骨鈣素通常用作分子標記，以確定血管平滑肌細胞的早期表型轉化為成骨細胞樣細胞；而Yamaguchi[6]等研究發(fā)現(xiàn)，骨橋蛋白可影響血管鈣化的形成，但仍有一些學者在動脈粥樣硬化斑塊和鈣化的主動脈瓣中檢測到骨橋蛋白的表達[7]。

本研究說明在鈣化過程中存在VSMCs向成骨細胞轉化的可能，對臨床心血管鈣化疾病的研究具有重要意義。但血管鈣化是一個復雜的過程，其機制仍需深入研究和探索。

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本文編輯：李淑雁

R543.5

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ISSN.2095-6681.2015.18.186.03

劉 超，男，主任醫(yī)師，E-mail：liubeilun@sohu.com

河南省教育廳科學技術研究重點項目（No.14B310016）