綠僵菌HC毒素合成酶基因的生物信息學(xué)分析

張杰等

摘要：通過生物信息學(xué)的方法對綠僵菌HC毒素合成酶基因進(jìn)行了分析。生物信息學(xué)分析表明，它在一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)上接近于植物病原真菌，但是其一級結(jié)構(gòu)上并不保守。

關(guān)鍵詞：NCBI；蛋白；核酸；生物信息學(xué)

中圖分類號： Q78文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2015）09-0071-03

收稿日期：2014-08-30

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號：31171897）；河南省教育廳自然科學(xué)研究計(jì)劃（編號：2010B180031）；周口師范學(xué)院科研成果孵化專項(xiàng)（編號：2011-zknufh）。

作者簡介：張杰（1975—），男，河南太康人，博士研究生，講師，研究方向?yàn)榉肿由飳W(xué)與生物工程。E-mail：zhangjiezk@qq.com。

通信作者：胡炳義，教授，研究方向?yàn)樯锛夹g(shù)。E-mail：bingyihu@126.com綠僵菌是農(nóng)業(yè)害蟲防治的主要病原真菌之一，其致病性主要依賴毒素麻痹宿主的防御。綠僵菌HC毒素是三輪狀結(jié)構(gòu)的環(huán)狀四肽（D-Pro-L-Ala-D-Ala-L-Aeo），Aeo表示2氨基9，10氟環(huán)唑8 3-羰基癸酸乙酯[1]。在玉米黑粉病中，HC毒素是黑粉病菌侵染玉米過程中的特異性和毒力的決定性因素[2]。HC毒素是微生物為數(shù)不多的第二代謝產(chǎn)物之一。在植物、昆蟲和哺乳動物中HC毒素是組蛋白脫乙?；福℉DACs）的抑制因子[3]，然而，昆蟲病原真菌侵染宿主時(shí)抑制宿主HDACs 致病和生物合成的機(jī)制尚不清楚[4-6]。利用生物信息學(xué)技術(shù)分析HC毒素合成酶的進(jìn)化 、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)、跨膜結(jié)構(gòu)域及物理化學(xué)性質(zhì)，可以為生物學(xué)功能的進(jìn)一步研究提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

以NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫中的綠僵菌數(shù)據(jù)庫為材料。

1.2方法

1.2.1序列的查找通過NCBI數(shù)據(jù)庫搜索HC毒素合成酶的蛋白序列，再通過綠僵菌數(shù)據(jù)庫NCBI/BLAST/tblastn搜索綠僵菌的核酸序列，進(jìn)而獲得HC毒素合成酶基因的全長序列。

1.2.2序列的生物信息學(xué)分析用DNAman軟件對HC毒素合成酶蛋白序列運(yùn)行clustalW、親水性、疏水性和跨膜結(jié)構(gòu)分析；應(yīng)用MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；用The PSIPRED Protein Sequence Analysis Workbench和COILS在線分析二級結(jié)構(gòu)，SMART在線分析二級結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)域；用swissmodel（http：//swissmodel.expasy.org/）數(shù)據(jù)庫在線建模和三級結(jié)構(gòu)分析[7-10]；用SignalP 4.1 Server預(yù)測蛋白序列的信號剪切位點(diǎn)；蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的預(yù)測用在線SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）；利用KEGG數(shù)據(jù)庫分析其所在的信號通路；利用ProtParam（http：//web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam）數(shù)據(jù)庫在線預(yù)測其物理和化學(xué)性質(zhì)。

2結(jié)果與分析

2.1HC毒素合成酶一級結(jié)構(gòu)和信號肽預(yù)測

基于一級結(jié)構(gòu)上的同源性對蛋白序列運(yùn)行clustalW和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。由圖1-A可知綠僵菌HC毒素合成酶總共有290個氨基酸，在一級結(jié)構(gòu)上保守型極低，在不同的病原菌中只有一個共同的甘氨酸位點(diǎn) （黑色、藍(lán)色和紅色區(qū)域分別表示相同性高于90%、75%和50%）。由圖1-B可知綠僵菌的HC毒素合成酶與半知菌類的蟲生真菌白僵菌具有較高同源性（88%），其次是動物病原菌（53%）。用SignalP 4.1 Server對其一級結(jié)構(gòu)上的信號肽進(jìn)行預(yù)測。由圖1-C表明該蛋白序列在第19個氨基酸位置具有信號肽位點(diǎn)，其預(yù)測分值為0.8，信號肽序列為MLLSSAAVVLGALQPALG，與swissmodel和SMART在線預(yù)測結(jié)果相一致，可能是分泌性蛋白。

2.2HC毒素合成酶二、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

在一級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上用COILS在線分析了HC毒素合成酶的二級結(jié)構(gòu)。從圖2可以看出，HC毒素合成酶有3個α-螺旋結(jié)構(gòu)，在蛋白中的含量為3.45%；13個β-折疊，其含量為16.55%；無規(guī)則卷曲最多，其含量為80%。而在線SMART預(yù)測到其內(nèi)部有2個重復(fù)序列及前端的信號肽序列，沒有預(yù)測到特征性結(jié)構(gòu)域。

2.3HC毒素合成酶親水性、疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)和分子結(jié)構(gòu)的預(yù)測

從圖3-A可知，HC毒素合成酶最高親水性分值為194，而最低分值為-1.91，總體親水性為-0.471；從圖3-B可知，HC毒素合成酶疏水性不顯著，其疏水性最高分值為303，最低值為-3.28，推測其可能是水溶性蛋白；從圖3-C可知，HC毒素合成酶沒有跨膜結(jié)構(gòu)。圖3-D是預(yù)測到的HC毒素合成酶的分子結(jié)構(gòu)，分子式為C1357H2136N390O417S24，分子量為31 355.6。

2.4HC毒素合成酶三維建模

從圖4-A和4-B可知，在SWISS-MODEL數(shù)據(jù)庫中搜

索到了HC毒素合成酶的模板，它與靶蛋白的相似性評估得分為37.93%（圖4-C），正常的QMEAN4分值為-3.52，靶蛋白與模型氨基酸的對應(yīng)序列如圖4-E所示。建模結(jié)果表明該蛋白的三維結(jié)構(gòu)與上述預(yù)測結(jié)果相一致。

2.5HC毒素合成酶抗原性片段、物理和化學(xué)性質(zhì)分析

用DNAman軟件預(yù)測到該氨基酸含有17個抗原肽段，其分值和長度（紅色字母表示最大分值位點(diǎn)）分別如下：

[1]分值=1.181，長度=21，4-SSAAVVLGALQPALGKPSLLR-24；[2]分值=1.179，長度=16，272-RPALCLIAGEPTCAPV-287；[3]分值=1.172，長度=12，204-DGLFCRHPCGGA-215；[4]分值=1.162，長度=22，246-ERCYKADDCDHGLFCEHQCGGA-267；[5]分值=1.162，長度=13，150-GDGLFCEHQCGGP-162；[6]分值=1.150，長度=7，108-AAFVCED-114；[7]分值=1.147，長度=26，40-AATEIVIDYLAPNPPCGPYSPWVGIW-65；[8]分值=1125，長度=13，119-AWIVSQPFKVDKE-131；[9]分值=1.123，長度=8，195-RCSQVNEC-202；[10]分值=1.123，長度=7，220-SNVCLIG-226；[11]分值=1.110，長度=10，228-EPTCAPVRQE-237；[12]分值=1.106，長度=7，32-NEVVNQR-38；[13]分值=1.090，長度=7，141-ERCYEAD-147；[14]分值=1.089，長度=15，168-SAMCFIAGEPKCRPI-182；[15]分值=1.080，長度=7，79-AWAYVKP-85；[16]分值=1.074，長度=7，67-ADACNSF-73；[17]分值=1.072，長度=14，93-NVKLNLSDLDVGEY-106。

其物理化學(xué)性質(zhì)用ProtParam在線預(yù)測，結(jié)果表明該蛋白的等電點(diǎn)為5.70，總共有4 324個原子組成，假定所有的半胱氨酸形成二硫鍵，它們在水中280 nm的消光系數(shù)為 33 680 L/（mol·cm）；假定所有的半胱氨酸是還原態(tài)，它們在水中 280 nm 的消光系數(shù)為32 430 L/（mol·cm）。其氮端起始氨基酸為Met，預(yù)測到該蛋白在哺乳動物網(wǎng)狀細(xì)胞中，離體狀態(tài)下的半衰期為30 h；在酵母活體中的半衰期為大于20 h；在細(xì)菌活體中的半衰期大于10 h。其不穩(wěn)定性指數(shù)為4172，屬于不穩(wěn)定性蛋白。其脂肪族指數(shù)為66.69。

3討論

利用生物信息學(xué)的方法對研究的基因進(jìn)行正確預(yù)測是現(xiàn)代分子生物學(xué)研究的有效手段之一[11-12]。隨著生物信息學(xué)算法和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測研究的深入，生物信息學(xué)在生物科學(xué)領(lǐng)域的研究非常重要[13]。HC毒素合成酶的同源序列比對及系統(tǒng)進(jìn)化樹的分析結(jié)果與Gao等的研究結(jié)論[14]一致，說明生物信息學(xué)預(yù)測是正確的。同軟件與在線對信號肽段預(yù)測結(jié)果相一致，與Nadine等的報(bào)道結(jié)果[15]一致。HC毒素合成酶的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測與Jones 等報(bào)道的玉米圓斑病菌相似[16]。HC毒素合成酶的物理化學(xué)性質(zhì)及抗原片段尚未有報(bào)道。總體來說，綠僵菌HC毒素合成酶結(jié)構(gòu)及功能接近禾本科病原菌，它與植物病原菌的異同尚需試驗(yàn)證明，其物理化學(xué)性質(zhì)也需進(jìn)一步的驗(yàn)證。表明生物信息學(xué)是現(xiàn)代生物學(xué)中重要的技術(shù)手段，與其他生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合是生物學(xué)研究的必要途徑。

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