梁魁景等

摘要：通過花藥形態(tài)和細(xì)胞學(xué)觀察，以測定磺酰脲類除草劑苯磺隆對甘藍(lán)型油菜中雙2號育性的影響。結(jié)果表明，苯磺隆誘導(dǎo)處理的花藥在形態(tài)上發(fā)生明顯改變，花藥皺縮、干癟缺水、顏色淡黃、纖維絲薄短、緊連蜜腺管底端、不形成花粉粒等；絨氈層的破壞是導(dǎo)致甘藍(lán)型油菜雄性不育的主要原因。

關(guān)鍵詞：苯磺隆；油菜；花藥；細(xì)胞學(xué)觀察

中圖分類號：S565.401文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2015）09-0128-02

油菜是人們?nèi)粘Ｉ钏枋秤糜秃驼{(diào)味料的重要資源，還可作為一種蔬菜。利用雜種優(yōu)勢是提升農(nóng)作物產(chǎn)量和價值的重要技術(shù)[1-2]，而油菜在產(chǎn)量和一些農(nóng)藝性狀方面具有顯著的雜種優(yōu)勢。阻止母本自我受精雖然降低了農(nóng)作物種子的純度，但對雜種的獲得具有重要的意義。開發(fā)利用雄性不育親本是確保母本異型雜交和大規(guī)模獲得F1代雜交種子的重要途徑。張寶娟等研究表明，通過葉面噴施15～20 mL磺酰脲類除草劑苯磺隆（TM）2次，能誘導(dǎo)甘藍(lán)型油菜中雙9號完全不育，且高效穩(wěn)定，是一種較好的油菜化學(xué)殺雄劑[3]。本研究通過苯磺隆誘導(dǎo)油菜品種中雙2號，對其花藥進(jìn)行形態(tài)和細(xì)胞學(xué)觀察，為揭示化學(xué)藥物誘導(dǎo)油菜雄性不育的機(jī)制提供形態(tài)和細(xì)胞學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

適合于河北省種植的冬性甘藍(lán)型油菜品種中雙2號，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所提供；化學(xué)殺雄劑75%苯磺隆水分散粒劑，由江蘇江南農(nóng)化有限公司生產(chǎn)。

1.2處理方法

2013年9月初，將油菜定植在大田，株行距為0.1 m×0.5 m；11月中旬，將油菜從大田移植到溫室，溫室條件：溫度為16～23 ℃，濕度為65～75%，光照16 h左右；在油菜抽薹高度為15～20 cm、最大花蕾長度為1～2 mm時，按苯磺隆最佳用藥量15～20 mL/單株，采用小型手動噴霧器均勻噴施于油菜葉片表面，以噴清水為對照。

1.3細(xì)胞學(xué)觀察

采用石蠟切片法對花藥進(jìn)行細(xì)胞學(xué)觀察。石蠟切片法流程采用李正理的方法[4]，將油菜穩(wěn)定的可育和不育性花序在雙蒸水 ∶無水乙醇 ∶醋酸為6 ∶3 ∶1的改良卡諾固定液中固定24 h；分別用30%、50%、70%、80%、95%、100%乙醇從低濃度到高濃度進(jìn)行梯度脫水；用二甲苯進(jìn)行透明，浸56～58 ℃石蠟，包埋；對石蠟塊進(jìn)行固著和整修，用Leica EM UC7超薄切片機(jī)進(jìn)行切片，切片厚度為1 μm；明膠黏貼劑黏片，37 ℃烘干超過24 h；蘇木精染色，阿拉伯樹膠封片，Olympus BX51顯微鏡觀察，獲得70 nm超微結(jié)構(gòu)，用JEM-1230型透射電子顯微鏡進(jìn)行拍照。

2結(jié)果與分析

2.1形態(tài)觀察

由圖1可見，正常發(fā)育的油菜花藥（噴清水）生長良好，長而豐滿，花粉粒數(shù)量眾多；苯磺隆誘導(dǎo)處理的油菜，雌蕊顯著長于雄蕊，花藥發(fā)育較差，呈淡黃色，皺縮，呈干燥的三角形，纖維絲薄短，與蜜腺管底端緊密相連，沒有花粉粒的形成。

2.2細(xì)胞學(xué)觀察

在花粉母細(xì)胞、四分體、單核細(xì)胞、成熟期4個發(fā)育時期，對中雙2號油菜花藥的細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。由圖2可見，在花粉母細(xì)胞時期，噴清水處理的油菜花藥，細(xì)胞結(jié)構(gòu)包括1層源表皮、藥室內(nèi)壁、中層及絨氈層，細(xì)胞質(zhì)的染色較均勻（圖2-A）；苯磺隆誘導(dǎo)藥物處理的油菜花藥，細(xì)胞源表皮、藥室內(nèi)壁、中層細(xì)胞沒有發(fā)生明顯變化，花粉母細(xì)胞的數(shù)量和形態(tài)也未發(fā)生改變，絨氈層雖然保持完整性，但有大量藍(lán)色物質(zhì)聚集在絨氈層細(xì)胞中央，周圍形成空泡結(jié)構(gòu)（圖2-B），與清水處理的花藥有明顯差別；在四分體時期，苯磺隆處理的油菜花藥絨氈層細(xì)胞遭到不同程度破壞，與對照（圖2-C）相比，其花藥雖然包括有完整的絨氈層，但細(xì)胞質(zhì)聚合成塊，周圍形成空泡狀，細(xì)胞數(shù)量和排布密度都有很大程度降低（圖2-D）；在單核期，清水處理的花藥小孢子出現(xiàn)空泡化，絨氈層也發(fā)生退化，這是單核晚期的表現(xiàn)（圖2-E），而苯磺隆誘導(dǎo)處理的花藥，其細(xì)胞絨氈層發(fā)生異常，大小不一，退化延遲，且無細(xì)胞核，小孢子細(xì)胞發(fā)生畸變而無活性（圖2-F）；在成熟期，清水處理的花藥中已經(jīng)形成許多去空泡化、可育的小孢子，絨氈層還存在，但已經(jīng)發(fā)生退化（圖2-G），而苯磺隆處理的花藥絨氈層已經(jīng)消失不見，小孢子數(shù)量很少，即使形成小孢子，也呈空泡化狀，呈現(xiàn)敗育性狀（圖2-H）。

3結(jié)論

苯磺隆屬于乙酰乳酸合酶抑制劑，是一類非常重要的磺酰脲類除草劑[5]，目前對其雜草清除的生化和分子機(jī)制已經(jīng)進(jìn)行了深入研究[6]。苯磺隆還是一種可高效誘導(dǎo)甘藍(lán)型油菜完全雄性不育的化學(xué)殺雄劑[3，7-8]，但當(dāng)前對其誘導(dǎo)植物雄性不育的細(xì)胞學(xué)機(jī)制還不是十分明確。

通過光學(xué)顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察分析苯磺隆誘導(dǎo)處理的油菜花藥細(xì)胞學(xué)形態(tài)發(fā)現(xiàn)，在花粉母細(xì)胞、四分體、單核細(xì)胞、成熟期4個發(fā)育時期，都能觀察到花藥細(xì)胞有缺陷的絨氈層，花粉母細(xì)胞時期絨氈層細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)濃縮聚集，形成空泡狀結(jié)構(gòu)，絨氈層細(xì)胞在單核期退化延遲。除此之外，在苯磺隆誘導(dǎo)處理的花藥中，還觀察到一些畸變的小孢子，最終導(dǎo)致成熟期花粉的敗育，與Cheng等研究結(jié)論[9-10]較為相似。這可能是因?yàn)楸交锹≌T導(dǎo)處理油菜花藥，使各個時期絨氈層的細(xì)胞發(fā)育異常，包括提早分裂、絨氈層與中間層剝離、延遲降解等，不能提供正?；ǚ郯l(fā)育所需的成分，形成敗育的小孢子，從而誘導(dǎo)油菜雄性不育，這種化學(xué)藥物誘導(dǎo)的油菜雄性不育，其花藥細(xì)胞學(xué)特性不同于受特定育性相關(guān)基因調(diào)控的細(xì)胞質(zhì)雄性不育和細(xì)胞核雄性不育[11-12]。

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