1株產(chǎn)3—羥基丙酸菌株的分離和鑒定

吳孔陽等

摘要：通過平板篩選，從土壤中分離出1株菌株Y31，并對該菌株進(jìn)行形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)、16S rDNA序列分析以及產(chǎn)物的薄層層析鑒定。結(jié)果表明，Y31菌株初步鑒定為短乳桿菌變種，能夠以丙酸為唯一碳源發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丙酸。

關(guān)鍵詞：3-羥基丙酸；分離；鑒定；短乳桿菌；薄層層析

中圖分類號(hào)： Q939.9文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）09-0381-03

3-羥基丙酸（3-hydroxypropionic acid，別稱β-hydroxypropionic acid，簡寫3-HP） 是一種重要的化工平臺(tái)產(chǎn)品，被美國能源部列為當(dāng)今世界12 種最具潛力的化工產(chǎn)品之一[1]。目前，3-HP主要通過丙烯酸水合法、β-丙內(nèi)酯水解法等化學(xué)合成方法制備，在生產(chǎn)過程中依賴一些特殊條件，且具有一定的危險(xiǎn)性[2]。而微生物技術(shù)方法逐漸成為當(dāng)前3-HP生物合成的研究熱點(diǎn)[3-6]，主要是通過自然選育、基因工程或代謝工程技術(shù)選育優(yōu)良的3-HP產(chǎn)生菌。從自然環(huán)境中選育的3-HP菌株主要有克雷伯氏菌、假絲酵母、假單胞菌、羅伊氏乳桿菌和紅串紅球菌等[2，7-10]。為了獲得其他具有潛在應(yīng)用價(jià)值的3-HP產(chǎn)生菌，本研究從不同的土壤環(huán)境中分離產(chǎn)3-HP菌株，并通過形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)和16S rDNA序列分析等方法對分離菌株進(jìn)行初步鑒定，以期為豐富產(chǎn)3-HP的微生物資源提供技術(shù)參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品土壤樣品采集自果園、耕田、化工廠周邊污水環(huán)境。

1.1.2培養(yǎng)基（1）初篩培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母膏10 g/L、瓊脂20 g/L，pH值自然，高壓滅菌后加入 0.1%～1.0% 丙酸。（2）復(fù)篩培養(yǎng)基：蛋白胨20 g/L、酵母膏 10 g/L、瓊脂20 g/L、pH值自然，高壓滅菌后加入05%丙酸。（3）發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨20 g/L、酵母膏10 g/L，pH值自然，高壓滅菌后加入0.5%丙酸。（4）斜面培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母膏10 g/L、瓊脂20 g/L，pH值自然。 菌落形態(tài)特征和生理生化試驗(yàn)所用培養(yǎng)基參考《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程》和《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》等相關(guān)資料[11-12]。

1.1.3主要試劑DNA Marker購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；Taq 酶、dNTP購自TaKaRa公司；3-HP標(biāo)準(zhǔn)品購自梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；細(xì)菌生理生化微量鑒定管購自杭州天和微生物試劑有限公司；TLC Silica gel 60 F254硅膠薄層層析板購自Merck公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1菌株初篩與復(fù)篩分別將樣品少許放入100 mL含有玻璃珠的無菌水中，輕輕混勻后靜置2 h，然后吸取0.1 mL懸浮液涂布于含有不同濃度丙酸的初篩培養(yǎng)基上。涂布完畢后，將平板倒置于30 ℃培養(yǎng)箱中放置24～72 h，用無菌牙簽將初篩平板上的單個(gè)菌落轉(zhuǎn)接到復(fù)篩培養(yǎng)基上，繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h，初步得到能夠在復(fù)篩培養(yǎng)基中生長的菌株。將復(fù)篩的菌株分別接種于10 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30 ℃、160 r/min的搖床中發(fā)酵48 h。發(fā)酵結(jié)束后，離心去除菌體得到發(fā)酵上清液以備用。另外，通過薄層層析初步鑒定產(chǎn)3-HP的菌株進(jìn)行純培養(yǎng)，純化后的菌株接種于斜面培養(yǎng)基中保存。

1.2.2菌株的形態(tài)學(xué)觀察和生理生化試驗(yàn)參考《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程》和《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》等相關(guān)資料對產(chǎn)3-HP菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和生理生化試驗(yàn)。本研究所進(jìn)行的生理生化試驗(yàn)主要包括糖發(fā)酵試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、脲酶測定、吲哚試驗(yàn)、過氧化氫酶試驗(yàn)、乙酰甲基甲醇試驗(yàn)（VP試驗(yàn)）以及甲基紅試驗(yàn)（MR試驗(yàn)）等。

1.2.3菌株的16S rDNA序列測定及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建菌株總DNA提取方法參考《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》[13]。16S rDNA的PCR擴(kuò)增條件如下：引物使用細(xì)菌通用引物（27 F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492 R：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′），20 μL的PCR擴(kuò)增體系包括10×PCR buffer 2 μL、dNTP 0.8 μL、27 F和1492 R引物各 05 μL、模版DNA 1 μL、Taq酶0.3 μL、無菌水14.9 μL。PCR反應(yīng)條件包括：94 ℃變性4 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸2 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物送至北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序，并將測得結(jié)果經(jīng)由GenBank進(jìn)行序列相似性搜索，然后采用Clustal X進(jìn)行序列聯(lián)配分析，系統(tǒng)發(fā)育分析通過軟件MEGA 6.0完成。

1.2.4產(chǎn)物的薄層層析為初步確認(rèn)所篩選的菌株是否產(chǎn)3-HP，通過薄層層析的方法進(jìn)行檢測分析，參照李冰等方法[14]并稍作修改，展開劑由正丁醇、甲酸和水按照 19 ∶1 ∶10 的體積比所構(gòu)成，顯色劑為0.1%溴甲酚綠，點(diǎn)樣體積為2 μL。

2結(jié)果與分析

2.1菌株的初步分離和形態(tài)觀察

將采集的樣品進(jìn)行多輪分離，最終得到1株能夠在復(fù)篩培養(yǎng)基中生長良好菌株，將其命名Y31，劃線分離出單菌落后進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證。從Y31菌落特征上看呈現(xiàn)乳白色、中間微凸起，48 h后呈淡黃色，不透明，直徑小于0.5 mm（圖1-A）。菌株Y31革蘭氏染色結(jié)果呈陽性，油鏡觀察到的顯微形態(tài)見圖1-B，單個(gè)細(xì)胞呈棒形球桿狀，兩端鈍圓，單個(gè)或成鏈狀排列。

2.2菌株的生理生化特性

2.2.1糖發(fā)酵測試通過一系列生理生化試驗(yàn)指標(biāo)對Y31菌株進(jìn)行測定。結(jié)果表明，該菌可利用乳糖、葡萄糖、麥芽糖、鼠李糖且不產(chǎn)氣，能液化明膠，不能利用棉籽糖、甘露醇（表1）。

表1糖發(fā)酵測試結(jié)果

糖類結(jié)果乳糖+葡萄糖+麥芽糖+棉籽糖-鼠李糖+甘露醇-明膠+注：“+”表示能利用或能液化；“-”表示不能利用。

2.2.2其他方法測試淀粉水解試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、乙酰甲基甲醇試驗(yàn)呈現(xiàn)陰性；脲酶測定試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)為陽性（表2） 。生理生化測定結(jié)果結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察，并對照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》（第8版）發(fā)現(xiàn)Y31菌株與短桿菌相似。

表2其他方法測試結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果淀粉水解-脲酶測定+吲哚-過氧化氫酶+VP-MR+注： “-”表示該試驗(yàn)為陰性；“+”表示該試驗(yàn)為陽性。

2.3菌株分子生物學(xué)鑒定

按照《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》所述方法，提取Y31菌株的基因組DNA，然后利用細(xì)菌通用引物擴(kuò)增該菌株的16S rDNA，經(jīng)測序獲得該菌株16S rDNA序列，片段大小為 1 430 bp。選擇Genbank中與Y31菌株16S rDNA序列相似性較高的已知菌株的16S rDNA序列，并構(gòu)建鄰接樹（N-J 法）。結(jié)果表明，菌株 Y31的16S rDNA序列與短乳桿菌具有較高的同源性，二者在以N-J 法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹上聚為同一簇群（圖2），而通過生理生化試驗(yàn)指標(biāo)分析發(fā)現(xiàn)，該菌株能夠利用鼠李糖，不能夠利用棉籽糖，另外該菌株能夠在以丙酸為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長，這與多數(shù)短乳桿菌有所不同，結(jié)合《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》（第8版），初步鑒定菌株Y31為短乳桿菌變種，命名為Lactobacillus brevis Y31。

2.4發(fā)酵產(chǎn)物的鑒定

將發(fā)酵液離心后獲取發(fā)酵上清液，然后進(jìn)行薄層層析分析，結(jié)果見圖3。通過測量點(diǎn)樣原點(diǎn)處到顯色斑點(diǎn)中心距離與原點(diǎn)至溶劑前沿距離，得出每個(gè)斑點(diǎn)的比移值Rf。計(jì)算得出發(fā)酵液和對照3-HP的Rf值接近，符合薄層層析定性要求，因此，初步確定Y31菌株所產(chǎn)的酸為3-HP。

3結(jié)論與討論

目前，化學(xué)法合成3-HP具有經(jīng)濟(jì)可行的優(yōu)勢，但從長久考慮，微生物法生產(chǎn)3-HP更加綠色環(huán)保。從相關(guān)文獻(xiàn)來看，微生物源3-HP的研究主要通過基因工程和代謝工程技術(shù)構(gòu)建3-HP的生物合成途徑，并證實(shí)了某些微生物體內(nèi)存在的3-HP代謝途徑[1，15]。相關(guān)試驗(yàn)尚處于試驗(yàn)階段，與生產(chǎn)應(yīng)用還有一定距離。另外，從自然環(huán)境中分離的產(chǎn)3-HP菌株幾乎都面臨產(chǎn)物的毒性、耐受性問題，甚至構(gòu)建的工程菌也存在相同的難題，有些基因工程菌還需依賴價(jià)格高昂輔酶B12[16]。

迄今已發(fā)現(xiàn)多種微生物能夠利用不同的碳源產(chǎn)生3-HP，本試驗(yàn)從自然環(huán)境中分離出1種新發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)3-HP菌株Y31，為該菌株的進(jìn)一步選育創(chuàng)造了條件。通過形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)、分子生物學(xué)技術(shù)初步鑒定Y31菌株為短乳桿菌變種，為微生物源3-HP代謝網(wǎng)絡(luò)研究提供一定的技術(shù)參考。

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