楊家大　陳祥　龍威?！●T文武　丁玫

摘要：為了揭示雷公山山區(qū)放牧山羊乙酰輔酶A羧化酶1（ACCl）mRNA表達(dá)的組織分布規(guī)律，使用TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)對(duì)黔東南小香羊、貴州白山羊、貴州黑山羊、黔北麻羊和南江黃羊的肝、腎、心、肺、背最長(zhǎng)肌、半膜肌以及皮下脂肪組織中ACCl基因的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，黔東南小香羊、黔北麻羊、南江黃羊ACCl mRNA均主要在皮下脂肪中表達(dá)，其水平分別為3 919.545 6、900.556 8、1 550.559 2；貴州黑山羊ACCl mRNA主要在肝臟內(nèi)表達(dá)，其水平為2 367.425 8；貴州白山羊ACCl mRNA主要在肌肉組織和肝臟中表達(dá)，其水平分別為背最長(zhǎng)肌420.110 9，心351.436 l，半膜肌268.031 l，肝200.414 1。在皮下脂肪和肝臟，貴州白山羊ACCl mRNA的表達(dá)水平都明顯低于其他品種。由此可見(jiàn)，雷公山山區(qū)放牧山羊ACCl mRNA主要在皮下脂肪和肝臟中表達(dá)。

關(guān)鍵詞：雷公山山區(qū)；放牧山羊；乙酰輔酶1；羧化酶1；ACCl；基因表達(dá)

中圖分類號(hào)：S827.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002-1302（2015）05-0025-04

雷公山山區(qū)位于貴州省東南部，草場(chǎng)面積約1.3萬(wàn)hm²，牧草種類多，工業(yè)污染少，非常適合發(fā)展生態(tài)養(yǎng)羊業(yè)。目前，當(dāng)?shù)厝藗內(nèi)匝赜脗鹘y(tǒng)放牧的養(yǎng)羊方式，山羊生長(zhǎng)過(guò)程中沉淀的風(fēng)味物質(zhì)多，羊肉質(zhì)量好。乙酰輔酶A羧化酶（ace@一CoA carboxylase，ACC）是一類在脂肪代謝過(guò)程中起重要作用的生物素包含酶，催化乙酰輔酶A羧化生成丙二酸單酰輔酶A。該酶廣泛存在于植物、動(dòng)物、酵母、真菌、細(xì)菌、古細(xì)菌等生物體內(nèi)。在動(dòng)物體內(nèi)，乙酰輔酶A羧化酶有乙酰輔酶A羧化酶α（acetyl-CoA carboxylase alpha，ACCα，別稱ACCl）和乙酰輔酶A羧化酶p（acetyl-CoA carboxylase beta，ACCp，別稱ACC2）2種類型，這2種酶由不同的基因編碼，分子量分別為265、280ku。ACCl主要存在于乳腺、脂肪組織和肝臟的細(xì)胞液內(nèi)，由它催化產(chǎn)生的丙二酸單酰輔酶A主要用于合成脂肪酸，是脂肪酸合成時(shí)二碳單位的供體；而ACC2主要分布在心臟、肌肉組織和肝臟的線粒體外膜上，由它催化產(chǎn)生的丙二酸單酰輔酶A主要用于調(diào)節(jié)肉堿棕櫚酸穿梭體。有研究表明，敲除ACC2基因的小鼠體內(nèi)丙二酸單酰輔酶A的含量低，導(dǎo)致脂肪酸的合成減少，氧化分解加快，脂肪組織和肝臟中堆積的脂肪減少，肝糖原含量下降；因此，乙酰輔酶A羧化酶可調(diào)節(jié)脂肪酸的生物合成和“β-”氧化，影響機(jī)體脂肪的代謝、沉積，進(jìn)而影響背膘厚等肉質(zhì)性狀。然而，現(xiàn)有資料對(duì)家畜ACCl的研究多集中在基因多態(tài)性與泌乳性能的關(guān)聯(lián)以及基因啟動(dòng)子方面，鮮見(jiàn)ACCl基因表達(dá)及其與肉質(zhì)性狀關(guān)系的研究；因此，本研究主要對(duì)雷公山山區(qū)放牧山羊ACCl基因mRNA的組織分布進(jìn)行探討，以摸清其組織表達(dá)規(guī)律，為肉質(zhì)性狀的遺傳標(biāo)記輔助選擇積累基礎(chǔ)資料。

1.材料與方法

1.1山羊組織樣品來(lái)源

5～7月齡黔東南小香羊、貴州白山羊、貴州黑山羊、黔北麻羊、南江黃羊各取4只（雌、雄各2只），體質(zhì)量14～17kg，均購(gòu)自貴州省雷公山山區(qū)養(yǎng)羊戶處。將山羊放血處死后，迅速提取心、肝、肺、腎、背最長(zhǎng)股、半膜肌、皮下脂肪組織，用錫箔紙包裹后投入液氮中。山羊處死前自由進(jìn)食和飲水。

1.2引物及探針

PCR引物及TaqMan探針根據(jù)山羊ACCl及β-actm基因mRNA序列設(shè)計(jì)（表1），并由上海捷瑞生物工程有限公司合成及修飾。探針的5'、3'一分別由FAM（6一羧基熒光素）和TAMRA（6一羧四甲基羅丹明）修飾。

1.3總RNA提取

總RNA提取采用Invitrogen Trizol RNA試劑盒進(jìn)行。操作簡(jiǎn)述如下：在約50 mg經(jīng)液氮速凍的組織樣品中加入1mLTrizol溶液，混勻，裂解5min；加入200uL三氯甲烷，劇烈振蕩混勻，靜置2min；4℃、12000r/min條件下離心15min，吸取上層水相至另一個(gè)新的RNase—flee EP管中；加入等體積的異丙醇，輕柔地充分混勻，室溫靜置10min；4℃、12000r/min條件下離心10min，收集RNA沉淀；用75%乙醇洗滌2次，超凈臺(tái)風(fēng)干；加入15～60uLRNase-flee水溶解沉淀。

1.4逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)采用TOYOBO ReverTra Ace qPCR RT Kit進(jìn)行（20uL體系），具體步驟如下：取總量為0.1～2.Oug的總RNA，加RNase—flee H20混勻至14uL，置于65℃下變性5min，冷卻；再加5×RTbuffer4uL、逆轉(zhuǎn)錄酶1uL、RT引物1uL，于42℃下逆轉(zhuǎn)錄18min，然后于98℃下滅活逆轉(zhuǎn)錄酶5min；RT完畢岳將cDNA于一20℃下保存，按所需用量稀釋備用。

1.5實(shí)時(shí)熒光定量標(biāo)準(zhǔn)品的制備

PCR反應(yīng)采用GeneSolution 2×Taq Master Mix（上海碩盟生物科技有限公司）進(jìn)行，反應(yīng)體系總體積為20uL，具體操作如下：向O.2 mL PCR管中依次加入RNase—flee H2O7.2uL、2×Taq Master Mix 10uL、10 t～mol/LS—F0.4uL、10umol/Ls—R0.4uL、cDNA 2uL，混勻。熱循環(huán)參數(shù)為：94℃預(yù)變性90s；94℃變性30s，55～60℃退火30s，72℃延伸60s，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]回收純化后，計(jì)算目的基因的拷貝數(shù)濃度，式中：Ⅳ為目的基因的拷貝數(shù)濃度（copies/uL），C為質(zhì)量濃度（ng/uL），M為擴(kuò)增片段的堿基對(duì)數(shù)。經(jīng)計(jì)算，ACCl基因、β-actm基因的拷貝數(shù)濃度為1.39×101¹¹、3.53×10⁷copies/uL。

膠回收產(chǎn)物按4倍比例進(jìn)行5次梯度稀釋。稀釋后再次測(cè)定質(zhì)量濃度、換算拷貝數(shù)濃度，最終得到拷貝數(shù)濃度為1.39×101¹¹、3.64×10l¹⁰、9.56×10⁹、2.39×10⁹、5.98×10⁸、1.49×10⁸eopies/p=L的ACCl基因連續(xù)梯度定量標(biāo)準(zhǔn)品，以及3.53×10⁷、8.82×10⁶、2.21×10⁶、5.51×10⁵、1.38×10⁵、3.45×10⁴copies/uL的β-actm基因連續(xù)梯度定量標(biāo)準(zhǔn)品。

1.6TaqMan PCR

反應(yīng)在Funglyn FTC-3000實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)（Funglyn Bioteeh，INC，Canada）上進(jìn)行，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，同時(shí)對(duì)空白對(duì)照及4倍連續(xù)梯度標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增。TaqMan PCR反應(yīng)體系為20 p=L，其中含2×Realtime PCRMaster Mix 10.0uL、10umol/L前弓l物0.8uL、10umol/L反引物0.8uL、10umol/L TaqMan探針0.4uL、RNase-fleeH20 6.0uL、cDNA模板2.0uL。熱循環(huán)參數(shù)為：95℃預(yù)變性10min；每個(gè)循環(huán)包括95℃變性15 s，63℃退火及延伸60s，40個(gè)循環(huán)。

1.7統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)ACCl及β-actut基因連續(xù)梯度標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)（以4為底）對(duì)相應(yīng)Ct值作圖，得到對(duì)應(yīng)基因的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程。再根據(jù)回歸方程與樣品檢測(cè)得到的Ct值即可計(jì)算出待測(cè)樣品中ACCl基因及β-actm基因的拷貝數(shù)。ACCl mRNA的個(gè)體表達(dá)水平以ACCl基因的拷貝數(shù)與β-actm基因的拷貝數(shù)之比值表示，平均表達(dá)水平以“中位數(shù)”表示。

2.結(jié)果與分析

雷公山山區(qū)放牧的黔東南小香羊、貴州白山羊、貴州黑山羊、黔北麻羊、南江黃羊等山羊品種肝、腎、心、肺、背最長(zhǎng)肌、半膜肌、皮下脂肪組織中ACCl基因的mRNA表達(dá)水平見(jiàn)表2。

從表2可以看出，黔東南小香羊ACCl mRNA的表達(dá)水平以皮下脂肪最高，為3919.545 6，是心（573.7526）、肝（812.0987）、肺（691.6713）、腎（286.0498）、背最長(zhǎng)?。?98.7109）和半膜?。?64.938 8）等組織的4.8倍以上；而肝、腎、心、肺、背最長(zhǎng)肌、半膜肌中ACCl mRNA的表達(dá)水平較接近。黔北麻羊ACCl mRNA的表達(dá)水平以皮下脂肪和肺較高，分別為900.5568和900.1608，是心（542.6041）、肝（288.7994）、腎（579.7442）、背最長(zhǎng)?。?18.3583）、半膜?。?72.1422）等組織的1.5倍以上。南江黃羊ACCl mRNA的表達(dá)水平以皮下脂肪最高，為1550.5592，是心（806.7845）、肝（803.6431）、肺（729.9683）、腎（519.4120）、背最長(zhǎng)?。?13.832 6）、半膜?。?60.483 3）等組織的1.9倍以上。貴州黑山羊ACCl mRNA的表達(dá)水平在肝臟中最高，為2367.4258，是心（592.7209）、肺（762.8970）、腎（321.6677）、背最長(zhǎng)?。?40.0147）、半膜?。?74.9263）、皮下脂肪（328.2781）等組織的3.1倍以上。貴州白山羊ACClmRNA的表達(dá)水平以背最長(zhǎng)?。?20.11109）、心（351.4361）、半膜肌（268.0311）、肝（200.4141）、肺（110.6160）較高，皮下脂肪（77.4306）和腎（22.8188）較低。

此外，在皮下脂肪中，黔東南小香羊和南江黃羊ACClmRNA的表達(dá)水平很高，分別為3 919.5456和1 550.5592；其次是黔北麻羊，為900.5568；貴州黑山羊和貴州白山羊則相對(duì)較低，分別為328.2781和77.4306。在肝臟中，貴州黑山羊ACCl mRNA的表達(dá)水平最高，為2367.4258；黔東南小香羊和南江黃羊較高，分別為812.098 7和803.6431；黔北麻羊和貴州白山羊相對(duì)較低，分別為288.7994和200.4141。

3.結(jié)論與討論

3.1雷公山山區(qū)放牧山羊ACCl mRNA主要在皮下脂肪和肝臟中表達(dá)

肉質(zhì)性狀作為數(shù)量性狀，受多基因控制，目前發(fā)現(xiàn)的候選基因至少有十幾個(gè)。ACCl是體內(nèi)脂肪合成的關(guān)鍵酶之一，參與長(zhǎng)鏈脂肪酸從頭合成的第1步反應(yīng)，對(duì)調(diào)控肝組織的脂肪代謝活動(dòng)具有重要作用，是豬屠宰及生產(chǎn)性能的標(biāo)志。ACCl抑制劑能夠抑制小鼠體質(zhì)量增加，減少小鼠的肥胖程度。因此，檢測(cè)ACCl mRNA水平能夠在轉(zhuǎn)錄水平上反映體內(nèi)脂肪合成能力。本研究對(duì)5個(gè)品種山羊7種組織ACCl基因的表達(dá)進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果表明，有3個(gè)品種（黔東南小香羊、黔北麻羊和南江黃羊）_4CCl基因最主要在皮下脂肪組織中表達(dá)，1個(gè)品種（貴州黑山羊）主要分布于肝臟，另一品種（貴州白山羊）的優(yōu)勢(shì)表達(dá)組織器官不明確。這與Barber等的報(bào)道較相似：他們認(rèn)為，哺乳動(dòng)物中ACCl在所有細(xì)胞中表達(dá)，但主要在肝臟、脂肪組織以及泌乳期乳腺等脂肪生成組織中表達(dá)。本研究結(jié)果還顯示，在皮下脂肪組織中，黔東南小香羊、黔北麻羊和南江黃羊ACCl mRNA的表達(dá)水平個(gè)體差異較大，這可能是由于皮下脂肪是ACCl基因表達(dá)的最主要組織，外界環(huán)境和山羊自身?xiàng)l件的微小變化都能引起ACClmRNA表達(dá)水平的較大改變，日糧中的氨基酸、中草藥、維生素、金屬離子等成分以及飽餓狀態(tài)等因素都能影響ACCl基因的表達(dá)。雷公山山區(qū)生態(tài)環(huán)境優(yōu)美，氣候溫和濕潤(rùn)，水質(zhì)好，植物種類繁多，有“天然藥園”之稱。該區(qū)放牧山羊長(zhǎng)期攝食這些植物和草藥，不僅為其肌肉生長(zhǎng)沉淀豐富的風(fēng)味物質(zhì)，而且可以通過(guò)影響ACCl基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯而最終影響屠宰性能，最終影響山羊的肉品質(zhì)量。

3.2ACCl mRNA的表達(dá)存在品種差異

就品種分布而言，無(wú)論是在表達(dá)水平最高的皮下脂肪中，還是在表達(dá)水平較高的肝臟中，貴州白山羊ACCl mRNA的表達(dá)水平都明顯低于其他山羊品種，這從轉(zhuǎn)錄層面說(shuō)明貴州白山羊的肝臟和皮下脂肪組織中丙二酸單酰輔酶A的合成能力較弱，生成的丙二酸單酰輔酶A較少，合成脂肪酸的原料不足，脂肪的合成速率降低，分解加快。Solaiman等也發(fā)現(xiàn)，ACCl基因的表達(dá)具有品種差異，波爾山羊顯著高于Kiko山羊。