蒙春蕾　王勇勇　黃敏　蔡爽　孟慶恒　孫建華

摘要：海洋來源的枝頂孢霉（Acremnium，BHO531）是一株以松材線蟲為靶標篩選出的殺線蟲真菌。氮源的化合態(tài)和種類對該菌株的生長以及代謝產(chǎn)物的活性有顯著影響。研究結(jié)果顯示，不同氮源對菌體生長量的影響差異顯著，有機氮優(yōu)于無機氮；代謝物的殺線蟲活性則表現(xiàn)為無機氮優(yōu)于有機氮，其中以NaNO3為氮源的發(fā)酵液對松材線蟲的殺線率以及NH4cl為氮源的發(fā)酵液對根結(jié)線蟲的殺線率分別高達95.67%和96.60%，均高于有機氮源中最高的蛋白胨。根結(jié)線蟲對各種無機氮源發(fā)酵液的敏感性普遍高于松材線蟲。此外，經(jīng)高溫處理的代謝物仍觀察到較強的殺線蟲活性，顯示出良好的熱穩(wěn)定性。

關鍵詞：海洋枝頂孢霉；氮源；殺線活性；松材線蟲；根結(jié)線蟲

中圖分類號：Q939.9；5；432.4.5 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2015）05-0121-03

植物寄生線蟲是一類世界性分布的重要植物病原物，其寄生范圍廣，環(huán)境適應性強，幾乎每種作物都受到植物線蟲的侵害，其危害程度僅次于真菌，已超過細菌、病毒，成為第二大植物病害，防控形勢嚴峻。真菌殺線劑（具殺線活性的代謝產(chǎn)物）是一類環(huán)境友好型生防因子，越來越受到廣泛重視。已經(jīng)報道的具有殺線蟲活性的真菌種類超過700種，已分離得到的殺線蟲活性代謝產(chǎn)物多達230余種。這些殺線蟲真菌及其代謝物的研究主要集中在陸生性真菌（包括病原菌和內(nèi)生真菌），如淡紫擬青霉活菌劑和總狀共頭霉（Srl8菌）等。海洋來源的枝頂孢霉（Acremnium，BHO531）是一株已被證實具有較好殺線蟲作用的海洋真菌。不同于陸生性真菌，該菌在添加海水的培養(yǎng)基中的生長情況和殺線蟲活性均優(yōu)于普通察氏培養(yǎng)基，且其代謝活性物具有含氮化合物屬性；因此，探究不同化合態(tài)的氮源對該菌在察氏培養(yǎng)基生長及其代謝物殺線蟲活性的影響，將有助于活性代謝產(chǎn)物發(fā)酵條件的優(yōu)化，克服海水高鹽組分對發(fā)酵設備的影響。據(jù)此，本試驗以松材線蟲、黃瓜根結(jié)線蟲二齡幼蟲（.T2）為對象，以殺線蟲效果（殺線率）為指標，測定了NaNO3、KNO3NH4NO3、（NH4），SO4、NH4Cl等不同氮源對BH0531菌株生長狀況及其活性代謝產(chǎn)物的影響，旨在為進一步優(yōu)化該菌的發(fā)酵條件提供試驗依據(jù)。

1.材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1供試菌株海洋枝頂孢霉（Acremnium，BHO531），菌種保藏號CGMCC-5445；灰葡萄孢霉（Batrytisnerea，BC菌），以上菌種由天津師范大學生命科學學院微生物實驗室提供。

1.1.2供試線蟲松材線蟲（Bursaphelenchusxylophilus），中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所提供；黃瓜根結(jié)線蟲（Meloido-gyneincognita）取白天津市寶坻區(qū)黃瓜大棚基地。

1.1.3供試培養(yǎng)基（1）活化培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200g/L煮汁，葡萄糖20g/L，瓊脂20g/L，蒸餾水定容至1000mL；用于活化BH0531菌株。（2）發(fā)酵培養(yǎng)基：2g/L氮源，1g/LKH2O4，0.5g/LMgSO40.5g/LKCl，0.01g/LFez（SO4）3·5H2O，20g/L葡萄糖，pH值自然。氮源分別為NaN0，、KNO3、NH4NO4、（NH4）：SO4、NH4C1、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏。（3）大麥仁培養(yǎng)基：10g大麥仁，8mL去離子水，大試管浸泡3～6h，滅菌，用于BC菌培養(yǎng)。

1.2試驗方法

1.2.1BH0531菌株的培養(yǎng)將保藏的BHO531菌種接種至活化培養(yǎng)基斜面試管，26qC培養(yǎng)5～7d。

1.2.2灰葡萄孢霉的培養(yǎng)

將灰葡萄孢霉接人大麥仁培養(yǎng)基，21℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7d，用于松材線蟲的培養(yǎng)。

1.2.3

松材線蟲的培養(yǎng)將松材線蟲接種于培養(yǎng)好的BC菌上，25℃下避光培養(yǎng)7d；通過貝爾曼漏斗法收集松材線蟲，制備成濃度為10000條/mL的線蟲懸液。1.2.4黃瓜根結(jié)線蟲二齡幼蟲（J2）的制將大田取得的黃瓜病根剪成1cm小段；在1%次氯酸鈉溶液中漂洗4min，再在勻漿機里攪拌2min；利用100目、300目和500目的網(wǎng)篩沖洗并收集蟲卯。再將卯收集到的離心管中，在底部加入40%蔗糖溶液，3500r/min密度梯度離心5min。之后吸取界面溶液過500目網(wǎng)篩，反復沖洗收集卯。將上述收集得到的卯置于已消毒的培養(yǎng)皿中，墊上濕潤濾紙，25qC下孵化4d。

1.2.5發(fā)酵液的制取活化的BHO531菌株斜面，加入無菌水洗脫孢子，制備濃度為2×10。CFU/mL的孢子懸液，以1%的接種量分別接入不同氮源發(fā)酵培養(yǎng)基中，26℃、120r/min培養(yǎng)96h。發(fā)酵菌液經(jīng)離心除菌（6000r/min30min，Eppendorf-5810），再經(jīng)孔徑為O.22um的微孔濾膜過濾，即為發(fā)酵濾液，用于活性分析。

1.2.6不同氮源發(fā)酵液殺線蟲活性檢測

將所獲發(fā)酵液分為滅菌組和未滅菌組，以無菌水為對照，分別以松材線蟲和黃瓜根結(jié)線蟲（J2）為靶標，進行殺線蟲活性檢測。具體方法如下：取96孔板，每孔加入靶標線蟲懸液10μL（約100條），再分別加入100μL不同氮源的發(fā)酵液，設3次重復，25℃下培養(yǎng)，3d后體視顯微鏡下觀測線蟲死亡情況，按下式統(tǒng)計線蟲校正死亡率：

線蟲校正死亡率=（處理線蟲死亡率一對照線蟲死亡率）/（1一對照線蟲死亡率）×100%。

應用SPSS12.0軟件對結(jié)果進行統(tǒng)計分析，并且采用Duncan's新復極差法進行差異顯著性分析。

2.結(jié)果與分析

2.1不同氮源對BH0531菌體生長的影響

試驗結(jié)果（圖1、表1）表明，不同氮源對BHO531菌絲體的外觀和生物量有明顯影響。圖1結(jié)果顯示，經(jīng)不同無機氮源發(fā)酵后，發(fā)酵液透明，呈淡黃色，菌絲球結(jié)構(gòu)松散，外觀不規(guī)整（圖1-A至E）；而在蛋白胨和酵母膏條件下，菌絲體外觀結(jié)構(gòu)緊密，呈均勻球狀分布，直徑明顯大于無機氮源條件（圖1-G至H）；牛肉膏中菌絲體則介于二者之間（圖l-F）。生物量測定結(jié)果進一步證實了不同氮源對該菌的影響存在明顯的差異（α=0.05），尤其體現(xiàn)在有機氮源和無機氮源之間（表1）。不同氮源對菌體生長的作用由大到小依次為蛋白胨>酵母膏>牛肉膏>KNO3>NaNO3>（NH4）2SO4>NH4NO3>NH4Cl。

2.2不同氮源發(fā)酵液對松材線蟲活性的影響

在試驗選定的8種氮源中，以NaNO，作為氮源的發(fā)酵液表現(xiàn)出了較好的殺線蟲活性，殺線率≥90%，達到A級（表1），其次為蛋白胨、NH4C1和KNO3，。值得關注的是除NH4cl外，其余3種氮源的發(fā)酵液經(jīng)滅菌后其代謝產(chǎn)物仍然具有≥60%的殺線活性，表明活性代謝產(chǎn)物具有較好的耐熱性。表1的分析結(jié)果顯示，代謝物的殺線蟲活性主要與氮源的種類密切相關，菌體生物量與代謝物殺線蟲活性在選定用量范圍內(nèi)未顯示出明確的相關性。這一結(jié)果提示，選用適當?shù)臒o機氮源如NaNO+用于發(fā)酵，從代謝活性物的角度可以代替海水培養(yǎng)基來獲得高活性的代謝產(chǎn)物。

2.3不同氮源發(fā)酵液對黃瓜根結(jié)線蟲（.T2）存活的影響

研究結(jié)果表明，BHO531代謝物不僅對松材線蟲有確切的殺線活性，對根結(jié)線蟲也有顯示出很強的殺線活性。不同氮源發(fā)酵液在滅菌前后，對黃瓜根結(jié)線蟲幼蟲J2的殺線率均較高，除牛肉膏、酵母膏外，其他6種氮源對根結(jié)線蟲的校正死亡率均大于75%（表2）。以NH4CI為氮源的發(fā)酵液對黃瓜根結(jié)線蟲的殺線率最高，達到96%，與該發(fā)酵液對松材線蟲的殺線率差異較大。表2結(jié)果還顯示，滅菌組中各氮源發(fā)酵液對黃瓜根結(jié)線蟲殺線率不僅差異顯著，還突出地表現(xiàn)出無機氮源的優(yōu)勢；未滅菌組中有機氮源間殺線率差異極顯著（P<0.01），無機氮源發(fā)酵液間殺線率差異雖不顯著，但其殺線率均在B級（>85%）以上，具有較高的殺線活性。進一步表明選用適當?shù)臒o機氮源用于BHO531活性代謝物的發(fā)酵，可以用來替代海水培養(yǎng)基獲得高活性的代謝產(chǎn)物。

3.討論

海洋來源的枝頂孢霉（Acremnium，BH0531）是一株以松材線蟲為靶標篩選出的生防菌，但該菌在海水培養(yǎng)基中顯示的生長優(yōu)勢并不適用于規(guī)模發(fā)酵的設備條件要求。而含氮無機鹽是海水中的重要成分，因此，探究其在不含海水的培養(yǎng)條件下的生長要素及其對殺線蟲活性代謝物的影響就顯得十分必要。研究結(jié)果表明，不同氮源，特別是無機氮源對BHO531生長狀況的影響較大。有機氮源雖然有利于菌絲體的增加，但其殺線率的優(yōu)勢并未隨菌絲體的增加而提高。試驗結(jié)果表明，以NaNO3和NH4C1 2種不同化合態(tài)的無機氮作為氮源時，菌體的生長狀況雖然不如有機氮，但所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物對松材線蟲與黃瓜線蟲分別顯示出較高的抑制率，且其活性產(chǎn)物均顯示出良好的熱穩(wěn)定性，為今后進一步優(yōu)化發(fā)酵條件、完全取代海水培養(yǎng)基提供了試驗依據(jù)。

研究還發(fā)現(xiàn)，BHO531代謝物對松材線蟲和根結(jié)線蟲的殺線效果存在一定的差異。根結(jié)線蟲對于以察氏培養(yǎng)基為基礎的不同氮源的發(fā)酵產(chǎn)物的敏感性明顯高于松材線蟲。有報道顯示，不同離子對南方根結(jié)線蟲的排斥性為K+、NH+和N03>Cl，其中NH+和NO+組成的化合物NH4NO3對南方根結(jié)線蟲有強烈的排斥力，且隨著濃度升高而上升。所不同的是，各種含氮無機鹽在BH0531的培養(yǎng)過程中作為氮源會被菌體轉(zhuǎn)化利用，而且用量僅為2g/L，低于察氏培養(yǎng)基的標準用量（3g/L），因此其高效的殺線蟲活性主要取決于代謝活性物的生成。至于其活性代謝物殺線蟲的機理還有待深入研究。