趙聯(lián)正　謝占玲　趙朋

摘要：為對植物病原菌鐮刀菌（Fusarium sp.）Q7-31所產(chǎn)木聚糖酶進行鑒定及酶學(xué)特性分析，在發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基上對Q7—31進行發(fā)酵培養(yǎng)，獲得能夠高效降解植物細(xì)胞壁的粗酶液。然后，采用Sephacry S-100凝膠柱層析和DEAE弱陰離子交換柱層析對粗酶液進行分離純化后得到木聚糖酶Xyn9，并對其開展蛋白質(zhì)組學(xué)研究和酶學(xué)特性分析。結(jié)果表明：粗酶液中木聚糖酶比活為16.58U/mg，纖維素酶比活為0.428U/mg，細(xì)胞壁降解酶比活為0.0198U/mg，蛋白含量為2.17mg/mL。Xyn9的蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果顯示，其分子量為21 ku、等電點為6.86，接近GHl0家族。純化后Xyn9的酶學(xué)特性表明，最適反應(yīng)溫度為47℃，最適pH值為5.6，該酶在33℃以下和在pH值5～6的范圍內(nèi)較穩(wěn)定；金屬離子K+對該酶有激活作用，Na+、Ca2+、Mg2+、Zn2+抑制該酶活性，Cu2+、Hg+使該酶完全失活。綜合Xyn9的分子量、蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果以及酶學(xué)特性，最終將其鑒定為一種新的介于GHl0家族與GHll家族之間的內(nèi)切木聚糖酶。

關(guān)鍵詞：鐮刀菌；木聚糖酶；分離純化；串聯(lián)質(zhì)譜鑒定；酶學(xué)特性

中圖分類號：Q55；Q814.1 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1002-1302（2015）05-0042-04

植物細(xì)胞壁主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等物質(zhì)組成。半纖維素的主要成分是木聚糖，約占植物細(xì)胞干質(zhì)量的30%-35%，是繼纖維素之后含量第二豐富的可再生物質(zhì)資源。其中，木聚糖酶（1，4-β-D—xylanase，EC 3.2.1.8）是一種重要的工業(yè)用酶，在造紙工業(yè)、能源、飼料及環(huán)境等領(lǐng)域中具有很好的應(yīng)用前景，特別是在紙漿的生物漂白方面的應(yīng)用。生物降解木質(zhì)素，就是利用微生物產(chǎn)生的胞外酶使木質(zhì)素逐步分解轉(zhuǎn)化，從而實現(xiàn)其資源轉(zhuǎn)化。所以，木質(zhì)素酶作為廢棄秸稈回收利用過程中的關(guān)鍵角色，已引起人們的高度重視。我國是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)大國，每年秸稈產(chǎn)量大約5.7億t，占世界秸稈總產(chǎn)量的20%～30%。其中絕大部分因為難以利用，僅作為農(nóng)家燃料或肥料。如果能夠?qū)⑦@些秸稈通過轉(zhuǎn)化成為低聚糖，就可以用作基本碳源，生產(chǎn)各種發(fā)酵產(chǎn)品，包括各種氨基酸、有機酸、單細(xì)胞蛋白、糖醇類、工業(yè)酶類、溶劑或燃劑等。因此，對木聚糖酶的研究具有十分可觀的經(jīng)濟效益和社會效益。

根據(jù)疏水性聚類分析方法，將木聚糖酶分為GHl0和GHl 1等2個家族。GHl0家族木聚糖酶多為高分子量，通常大于30ku，等電點較低，不僅有催化結(jié)構(gòu)域，還常有碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域；GHl1家族木聚糖酶多為單結(jié)構(gòu)域蛋白，相對分子量一般小于30ku，等電點較高。而且2個家族的木聚糖酶在空間結(jié)構(gòu)上的折疊類型不同，即GHl0家族木聚糖酶主要由重復(fù)出現(xiàn)的α-螺旋和β-折疊片構(gòu)成，整體結(jié)構(gòu)像碗狀，上面略大下面較??；而GHll家族木聚糖酶具有的典型折疊結(jié)構(gòu)是由β-折疊片為主所構(gòu)成的單個結(jié)構(gòu)域，這個結(jié)構(gòu)域由2個β-折疊片層扭曲成將近90°角，構(gòu)成1個深且狹長的溝縫狀結(jié)構(gòu)。

近10年來，基因重組、基因定位突變、細(xì)胞融合等技術(shù)在纖維素酶菌株的構(gòu)建上取得了巨大的成果。對于木聚糖酶而言，酶活力偏低是研究開發(fā)中遇到的普遍問題，低酶含量造成發(fā)酵成本過高，限制了該酶制劑的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用。一般來說，真菌木聚糖酶比細(xì)菌的木聚糖酶產(chǎn)量大，例如木霉、曲霉等真菌所產(chǎn)木聚糖酶的酶活力較高，對木聚糖酶的研究也主要集中在這些方面。鐮刀菌是一種世界性的土生絲狀真菌，其中有一些可以產(chǎn)生多種酶，其能夠降解細(xì)胞壁中的果膠與纖維素。由于鐮刀菌屬于病原菌，對鐮刀菌的研究多集中在對致病性鐮刀菌的檢測鑒定、多樣性與致病基因等方面，對利用其產(chǎn)酶的研究鮮有報道。本研究對鐮刀菌（Fusarium sp.）Q7-31產(chǎn)細(xì)胞壁降解酶進行分離純化，并對純化后的木聚糖酶進行蛋白鑒定與酶學(xué)特性分析，鑒定出介于GHl0家族與GHll家族的內(nèi)切木聚糖酶Xyn9，為后續(xù)研究細(xì)胞壁降解酶降解細(xì)胞壁的協(xié)同反應(yīng)機制、反應(yīng)條件及酶系的結(jié)構(gòu)組成奠定基礎(chǔ)。

1.材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株鐮刀菌Q7-31菌株，由青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院微生物實驗室于2007年從青海省大通縣寶庫鄉(xiāng)所采土壤中自行分離純化獲得，并保存。

1.1.2培養(yǎng)基

固體活化培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基粉末39g，1 000mL水，121 qC滅菌20min；液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖2%，蛋白胨0.3%，Mendels營養(yǎng)鹽，121℃高壓滅菌20min；發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基：燕麥秸稈粉0.3%，蛋白胨0.3%，Mendels營養(yǎng)鹽，121℃高壓滅菌20min；Mendels營養(yǎng)鹽：（NH4）：SO4 1.4g/L、KH2PQ 2.0g/L、尿素0.3g/L、CaCl20.3g/L、MgSO4 0.3g/L、FeSO4 5.0 mg/L、MnSO4 1.6mg/L、ZnSO4 1.4mg/L、COCl2 2.0mg/L。

1.2方法

1.2.1菌種活化與發(fā)酵將保存在4℃下液體石蠟封存的斜面菌種Q7-31轉(zhuǎn)接至固體活化培養(yǎng)基上，于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，傳代2～3次，使菌種充分活化。液體種子制備：在1000mL三角瓶中裝入200mL液體種子培養(yǎng)基，從固體活化培養(yǎng)基上接種直徑為1.0cm的菌塊至液體種子培養(yǎng)基中，于25℃恒溫培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)2d后制成液體種子備用。液體發(fā)酵培養(yǎng)：在1000mL三角瓶中裝入350mL發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基，將制備好的液體種子按10%接入發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，25℃ 120r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)。1.2.2酶活力的測定采用3'，5'二硝基水楊酸（DNS）測定還原糖的方法，測定分別以1%木聚糖、0.5%羧甲基纖維素（cMC）及5mg/mL燕麥秸稈粉為底物時酶液中木聚糖酶、纖維素酶和植物細(xì)胞壁降解酶的活力。將1min產(chǎn)生1ug還原糖所需的酶液量定義為1個酶活力單位（u）。

1.2.3蛋白含量的測定

蛋白含量的測定采用Bradford法，以牛血清白蛋白（BsA）為標(biāo)準(zhǔn)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在2mL離心管中加入稀釋3倍的酶液樣品200uL，加入1mL考馬斯亮藍(lán)G-250染液，充分振蕩混勻反應(yīng)5min，60min內(nèi)在595nm下測定吸光度。將測得的吸光度代入蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計算樣品中的蛋白含量。

1.2.4酶的分離純化用50%～80%飽和度的硫酸銨對蛋白含量較高的酶液進行分級沉淀，后將6mL沉淀后的樣品上樣到Sephacry s-100葡聚糖凝膠層析柱（26mm×700mm），層析柱預(yù)先用pH值為7.5的Tris-HCl緩沖液平衡，并以相同緩沖液進行洗脫，速度為1.3mL/min，用核酸蛋白檢測儀在280nm波長下檢測蛋白分布，對每個收集管進行標(biāo)號；將初步分離的蛋白樣品上樣到DEAE弱陰離子交換柱（5×5mL），柱子預(yù)先用20mmol/L Tris—HCl緩沖液（pH值為7.5）平衡，以O(shè)～1mol/L的NaCl進行梯度洗脫，速度為0.5mL/min，每4min收集1管，用核酸蛋白檢測儀在280nm波長下檢測蛋白分布。

1.2.5SDS一聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）將制好的分離膠和濃縮膠灌入電泳槽后，把蛋白Loading Buffer與待測收集管中的樣品混合，于100℃沸水浴中加熱5min，取出后冷卻至室溫。每個點樣孔上樣10uL，并使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量作為參照。當(dāng)溴酚藍(lán)前沿到達(dá)距凝膠下沿約0.5cm時，停止電泳。使用小刀將凝膠輕輕撬離玻璃板，然后將凝膠剝離到裝有染色液（考馬斯亮藍(lán)R-250染色液1%，甲醇40%，冰醋酸10%，混勻并過濾）的培養(yǎng)皿中，染色3～4 h。染色完畢后，倒出染色液，加入脫色液（甲醇10%，冰醋酸10%，混勻），脫色3～10h，定時更換脫色液，直至凝膠背景變得清晰可見。

1.2.6酶的質(zhì)譜鑒定酶的質(zhì)譜鑒定由華大基因（北京）完成。切下的目的蛋白凝皎位點，加入50mmol/L NH4HCO，振蕩至無色；加入乙睛100uL約放置30min'，通過1ug/mL胰蛋白酶酶解37℃水浴16h，加入100uL提取液（50%乙睛，5%TFA），40℃水浴1h，真空干燥除去乙睛，加入5uLO.1%三氟乙酸。取2ug的樣品用Angilent 1100液相系統(tǒng)Finnigan線性離子阱（LTQ）質(zhì)譜儀系統(tǒng)進行檢測，質(zhì)譜結(jié)果經(jīng)MASCOT軟件檢索，結(jié)合NCBI數(shù)據(jù)庫信息以及酶學(xué)特性確定酶的種類。

1.2.7酶的最適溫度、pH值及穩(wěn)定性測定最適溫度的測定：將底物處于pH值6.8的緩沖液中，在4～90℃范圍中進行酶促反應(yīng)，確定酶的最適反應(yīng)溫度；在上述不同溫度下溫浴處理1h測定酶的穩(wěn)定性。最適pH值的測定：將底物處于不同pH值的緩沖液中，pH值范圍為3～8，在45℃條件下反應(yīng)并測定酶活力，確定最適反應(yīng)pH值。穩(wěn)定性測定：將樣品分別在pH值為3.0～11.0的條件下處理1h，測定酶的pH值穩(wěn)定性。

1.2.8金屬離子對酶活力的影響分別在酶液中加入金屬離子化合物Na+、K+、zn+、Cu2+、Fe2+、Mg2+、Mn2+、Ca2+、Hg2+，各種金屬離子在反應(yīng)體系中的終濃度分別達(dá)到4、8mmol/L。40℃處理30min后測定殘余木聚糖酶活力，未加金屬離子的酶活力為100%。

2.結(jié)果與分析

2.1Q7-31發(fā)酵液的酶活力和蛋白含量

2.1.1酶活力Q7-31發(fā)酵液的酶的木聚糖酶活力最強，在酶液稀釋100倍情況下其木聚糖酶活力高達(dá)35.96U/mL；其次具有一定的纖維素酶活力，在酶液稀釋10倍的情況下，纖維素酶活力為0.929U/mL；而酶液在沒有稀釋的情況下，細(xì)胞壁降解酶活力只有0.043U/mL（表1）。以上結(jié)果表明，Q7-31發(fā)酵液的酶主要具有木聚糖酶活力。

2.1.2蛋白含量過濾后的酶液總體積為1 400 mL，595 nnl下的吸光度為0.840，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線公式（y=0.8609x，r²=0.9994），得到酶液總蛋白含量為3037.26mg。

2.2酶的分離純化及SDS-PAGE

1400mL粗酶液經(jīng)過50%～80%硫酸銨分級沉淀后，得到12 mL酶液，蛋白含量為1248.99mg，蛋白回收率為41.12%。將酶液上樣到Sephacry s-100葡聚糖凝膠層析柱中進行初步分離純化，得到只具有木聚糖酶活性的蛋白，將其命名為Xyn9，其酶活力為47.26U/mL，蛋白含量為5.824mg，比活為24.34U/mg，SDS-PAGE檢測結(jié)果證明其為單一蛋白，分子量為21ku（圖1）。再將初步分離純化的Xyn9上樣到EzFast DEAE弱陰離子交換柱中進一步分離純化，柱子預(yù)先用pH值為8.5的Tris-HCl緩沖液平衡，以0～1mol/L NaCl進行梯度洗脫，速度為0.5mL/min，得到純化過的Xyn9。

2.3Xyn9的質(zhì)譜鑒定

選取雙向電泳為1個點的Xyn9蛋白進行串聯(lián)質(zhì)譜鑒定，

2.4xyn9的酶學(xué)特性

2.4.1Xyn9的最適溫度及溫度穩(wěn)定性Xyn9的最適反應(yīng)溫度為47℃，在37～52℃范圍內(nèi)都有較高的酶活力，溫度過低或過高都不利于酶促反應(yīng)；Xyn9在33℃以下穩(wěn)定性高，當(dāng)溫度高于33℃酶活力迅速降低直至為O（圖3）。

2.4.2Xyn9的最適pH值及pH值穩(wěn)定性純化的低分子量木聚糖酶Xyn9的最適反應(yīng)pH值為5.6；Xyn9在pH值為5～6的范圍內(nèi)具很好的穩(wěn)定性（圖4）。

2.4.3金屬離子對Xyn9酶活力的影響

金屬離子對木聚糖酶Xyn9酶活力具有明顯的影響。K+在4、8 mmol/L離子強度條件下對該木聚糖酶活力都有一定的激活作用，且離子濃度越大，激活效果越好；Na+、Ca2+、Mg2+、Zn2+對該酶有不同程度的抑制作用；Hg2+、cu2+則完全抑制該木聚糖酶的活力（圖5）。

2.5Xyn9的鑒定

由于Xyn9的質(zhì)譜鑒定結(jié)果表明其接近但不屬于GH10結(jié)果表明：由于Mascot Score為37分，不足證明其為GHl0家族內(nèi)切木聚糖酶的47分（P<0.05），因此Xyn9接近但并不屬于GHl0家族內(nèi)切木聚糖酶（NCBI注冊號：gi1170139）。理論等電點（PI）為6.86，質(zhì)譜鑒定結(jié)果如圖2所示，匹配的肽段序列為VLGEDFVGIAFR，覆蓋范圍為3%。家族內(nèi)切木聚糖酶，而低分子量以及酶學(xué)特性表明其接近GHll家族內(nèi)切木聚糖酶。因此，最終將其鑒定為一種新的介于GHl0與GHll家族之間的內(nèi)切木聚糖酶。

3.結(jié)論與討論

對鐮刀菌Q7-31發(fā)酵液進行酶活力測定，結(jié)果表明，發(fā)酵液具有木聚糖酶、纖維素酶與植物細(xì)胞壁降解酶活力，并且植物細(xì)胞壁降解酶活力較強，這種多種酶的組合在真菌中并不常見。這可能是其生活方式與環(huán)境相適應(yīng)而長期進化的結(jié)果，作為植物病原菌，多種酶的協(xié)同作用可能有助于其高效感染植物，完成其生活過程。此外，病原菌木聚糖酶可能作為激發(fā)子，誘發(fā)植物的抗病防御反應(yīng)，在植物與病原菌互作機制研究和植物抗病防病領(lǐng)域中備受關(guān)注，病原菌木聚糖酶由于能分解植物細(xì)胞壁而可能促進病原菌的侵染，且病原菌木聚糖酶還可能同時誘發(fā)植物的抗病防御系統(tǒng)，病原菌木聚糖酶的這種雙重作用已成為近年來植物一病原菌互作關(guān)系研究中的一個熱點，因此侵染過程需要一系列酶的協(xié)同作用。植物半纖維素的完全水解需要一系列酶協(xié)同完成，并且這些酶共同作用致使粗酶液具有較高的比活力。其中的小分子木聚糖酶更容易穿透植物纖維壁結(jié)構(gòu)，發(fā)揮高效的降解作用。而一些木聚糖酶具有一些特殊結(jié)構(gòu)區(qū)域，有利于和底物結(jié)合，熱穩(wěn)定區(qū)域和糖基化結(jié)構(gòu)使其穩(wěn)定性在不同環(huán)境中更好。

筆者在之前的研究中，已經(jīng)克隆出編碼Xyn8蛋白（同樣從Q7-31中分離出）的Xyn8基因，并且實現(xiàn)了其在大腸桿菌中的原核表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其為25.7ku的GHll家族內(nèi)切木聚糖酶，其最適溫度、pH值分別為40℃、6.0。將本研究所得到的Xyn9與Xyn8對比后發(fā)現(xiàn)，Xyn9的分子量以及酶學(xué)特性與Xyn8類似，即接近GHll家族內(nèi)切木聚糖酶，但兩者基因序列的對比結(jié)果（57%）證明其不屬于GHll家族。此外，雙向電泳后的串聯(lián)質(zhì)譜鑒定結(jié)果表明其接近但不屬于GHl0家族內(nèi)切木聚糖酶。因此，根據(jù)Xyn9的分子量、質(zhì)譜鑒定結(jié)果以及其酶學(xué)特性，將其最終鑒定為一種新的介于GHl0與GHl 1家族之間的內(nèi)切木聚糖酶。但由于其作為病原菌所產(chǎn)酶的特殊性，后續(xù)著重解決其歸屬問題。

Xyn9的酶學(xué)特性研究表明其最適反應(yīng)pH值為5.6，低于33～C時酶活力較穩(wěn)定，最適反應(yīng)溫度為47℃。多數(shù)真菌木聚糖酶的最適反應(yīng)pH值在5左右，pH值穩(wěn)定范圍為5～6，最適反應(yīng)溫度為40～70℃，低于50℃較穩(wěn)定。但也有一些報道認(rèn)為最適pH值在更酸或偏中性環(huán)境中，如lefuji等從酵母菌Cryptococcus sp.S-2中分離得到一種小分子量內(nèi)切木聚糖酶，其最適反應(yīng)pH值為2.0，且當(dāng)pH值為1.0時仍能保持75%的酶活力。另外一些木聚糖酶在極端pH值和溫度條件下酶活力不但高而且穩(wěn)定，在工業(yè)應(yīng)用方面有很好的前景。如木聚糖酶應(yīng)用于造紙業(yè)中需要其能夠受耐高溫（55～70℃）和堿性環(huán)境，在生物轉(zhuǎn)化方面甚至需要一些嗜熱嗜堿和嗜熱嗜酸性的木聚糖酶。這就需要通過菌株篩選、誘變、基因工程或者蛋白工程等方法來提高木聚糖酶的水解效率和穩(wěn)定性，這也是目前木聚糖酶研究的一個主要方向。金屬離子K對木聚糖酶Xyn9具有很強的激活作用，在一定范圍內(nèi)，其濃度越大作用越強，而Na+、ca2+、Mg2+、zn2+對該酶有不同程度的抑制作用很少有報道。重金屬離子Hg2+、cu2+對木聚糖酶具有完全的抑制作用，這與許多報道結(jié)果一致，可能由于Hg2+、Cu2+能夠改變酶的構(gòu)象從而使酶失活。