朱鑫　易潭　陳琳　等

摘要為了解翹嘴鱖胚胎發(fā)育中miR146a的表達(dá)規(guī)律以及溫度對miR146a表達(dá)的影響，將翹嘴鱖受精卵分別在22 ℃和25 ℃水溫下孵化，并利用實(shí)時(shí)熒光定量方法檢測miR146a在各個(gè)發(fā)育階段的表達(dá).結(jié)果顯示，在22 ℃孵化時(shí)，miR146a的表達(dá)在原腸期前處于較高水平且各時(shí)期表達(dá)沒有顯著性差異（P>0.05），在尾芽期后出現(xiàn)顯著性降低（P<0.05），并在出膜時(shí)達(dá)到最低值；在25 ℃孵化時(shí)，miR146a的表達(dá)直到神經(jīng)胚期仍處于較高水平且各時(shí)期表達(dá)沒有顯著性差異（P>0.05），發(fā)育進(jìn)入尾芽期后表達(dá)顯著降低（P<0.05），在肌效期達(dá)到最低值；miR146a在25 ℃水溫孵化時(shí)的表達(dá)較22 ℃孵化同時(shí)期的表達(dá)都出現(xiàn)顯著降低（P<0.05）.研究表明，miR146a可能主要在胚胎發(fā)育后期起到調(diào)控胚胎發(fā)育的作用，在尾芽期后通過下調(diào)表達(dá)來促進(jìn)胚胎的發(fā)育；并且溫度能影響miR146a的表達(dá)，溫度升高會(huì)降低miR146a在胚胎發(fā)育各個(gè)時(shí)期的表達(dá)，將有利于胚胎的發(fā)育.

關(guān)鍵詞翹嘴鱖；miR146a；發(fā)育性表達(dá)；胚胎發(fā)育；溫度調(diào)節(jié)

中圖分類號(hào)Q752； S917.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)10002537（2015）05002106

Expression Analysis of Siniperca Chuatsi MiR146a During Embryonic

Development and Effect of Temperature on MiR146a Expression

ZHU Xin 1，2#， YI Tan 1，2#， CHEN Lin1， WU Ping1， WANG Jianhua1，

CHEN Tao2， ZHANG Jianshe 1， CHU Wuying 1*

（1.Department of Biological and Environmental Engineering， Changsha University， Changsha 410003， China；

2. College of Veterinary Medicine， Hunan Agriculture University， Changsha 410128， China）

AbstractTo investigate the expression pattern of miR146a in embryonic developmental stage and the effect of temperature on the expression of miR146a in Siniperca chuatsi， the embryos were incubated under different temperatures and the expression of miR146a during embryonic developmental stage was detected by RTqPCR. The results showed that the expressions of miR146a were at a higher level and there is no significant difference before gastrula stage when the embryos incubated under 22 ℃ （P>0.05）. And then the expressions of miR146a decreased after tailbud stage and decreased to the lowest level at larval stage （P<0.05）. When the embryos incubated under 25 ℃， the expressions of miR146a were at a higher level and there is no significant difference till neurula stage （P>0.05）. Once at tailbud stage， the expression of miR146a significantly decreased （P<0.05） and to the lowest level at muscular effect stage. It was interesting that the expressions of miR146a were significantly decreased at each developmental stage incubated under 25 ℃ when compared with 22 ℃ incubation （P<0.05）. The results indicated that miR146a mainly involved in regulating embryonic development during later embryonic developmental stages and promoted embryonic development by down regulation its expression. In addition， the expressions of miR146a could decrease when the incubation temperature increased， and miR146a might involve in the effect of temperature on embryonic development of Siniperca chuatsi.

Key wordsSiniperca chuatsi； miR146a； developmental expression； embryonic development； temperature regulation

上世紀(jì)80年代，隨著鱖魚人工繁殖獲得成功，我國開始大規(guī)模推廣鱖魚養(yǎng)殖，使之成為我國主要名貴養(yǎng)殖魚類之一.翹嘴鱖因其肉質(zhì)細(xì)嫩而鮮美，無小刺，且富含蛋白質(zhì)，現(xiàn)已成為水產(chǎn)品市場的緊俏商品和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的重要品種[1].深入探索翹嘴鱖的發(fā)育機(jī)制能夠?yàn)轸~類發(fā)育生物學(xué)研究和水產(chǎn)養(yǎng)殖提供一些有價(jià)值的參考資料.

microRNA（miRNA） 是真核生物中一類進(jìn)化上保守的參與調(diào)控基因表達(dá)的非編碼小分子RNA.它通過與靶基因3′端非翻譯區(qū)互補(bǔ)配對來促進(jìn)靶mRNA 降解或翻譯抑制，在基因表達(dá)中起著負(fù)調(diào)控作用[23].miRNA在胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖與分化、腫瘤發(fā)生和新成代謝等一系列生物過程中發(fā)揮重要的作用[45]，但是有關(guān)miRNA在胚胎的表達(dá)特性及其在魚類早期發(fā)育中的功能研究還很少.早期的研究表明miRNA對胚胎發(fā)育起到重要作用.鼠和人的胚胎干細(xì)胞在發(fā)育形成胚胎小體時(shí)，胚胎干細(xì)胞中一些特定的miRNA的表達(dá)會(huì)下調(diào)[67]，缺失miRNA的鼠和斑馬魚胚胎在原腸胚形成、神經(jīng)發(fā)育、體節(jié)形成時(shí)出現(xiàn)發(fā)育畸形甚至停滯[89].Kuang等[10]發(fā)現(xiàn)miR146a能夠與Numb基因的3′端非翻譯區(qū)互補(bǔ)配對，并且驗(yàn)證了miR146a能夠抑制Numb的表達(dá)，而Numb調(diào)控的靶基因Notch參與一系列胚胎發(fā)育和形態(tài)形成過程，如成肌細(xì)胞的增殖、神經(jīng)發(fā)育和體節(jié)形成[11]，因此可以推斷miR146a很可能參與調(diào)控胚胎的發(fā)育.

水溫可以改變胚胎發(fā)育所需時(shí)間，較高的孵化溫度能加速魚類胚胎的發(fā)育速率，縮短孵化所需的時(shí)間[12].何利君[13]的研究顯示，翹嘴鱖胚胎發(fā)育在21，25和27 ℃下，分別經(jīng)過74.05，56.73和48.37 h孵育后出膜.在適宜溫度范圍內(nèi)，適當(dāng)升溫可以加快胚胎發(fā)育的進(jìn)程，但miRNA是否參與到水溫影響翹嘴鱖胚胎發(fā)育的分子機(jī)制中尚不明確.在本研究中，我們分別在22和25℃水溫下孵化翹嘴鱖的受精卵，并利用實(shí)時(shí)熒光定量的方法檢測miR146a在幾個(gè)重要發(fā)育階段的表達(dá)，以此了解miR146a在胚胎發(fā)育進(jìn)程中的表達(dá)模式及水溫對miR146a表達(dá)的影響.

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)魚

實(shí)驗(yàn)用親魚為湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所無病無傷、體格健壯、性腺成熟度好的翹嘴鱖，雌性個(gè)體為體質(zhì)量1.0 kg以上的2～4齡魚，雄性個(gè)體為體質(zhì)量0.75 kg以上的2～4齡魚.

湖南師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào)第38卷第5期朱鑫等：翹嘴鱖miR146a在胚胎發(fā)育過程中的表達(dá)及溫度對其表達(dá)的影響1.2方法

1.2.1不同溫度下胚胎的孵化和取樣使用寧波市激素制品有限公司生產(chǎn)的絨毛膜促性腺激素（HCG）、促黃體生成素釋放激素類似物和鯉鯽魚腦垂體（PG）對親魚進(jìn)行人工催產(chǎn)，操作方法參考劉希良[14]等文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo).將受精卵置于直徑15 cm的玻璃培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿放200～300顆，分別在22 ℃和25 ℃的水溫中孵化.期間，每半小時(shí)更換一次曝氣水以保證溶氧充足.自受精后定時(shí)將翹嘴鱖魚卵置于顯微鏡下觀察翹嘴鱖胚胎的發(fā)育進(jìn)程，當(dāng)所有魚卵半數(shù)以上達(dá)到某個(gè)時(shí)期時(shí)確定為到達(dá)該時(shí)期.當(dāng)受精卵進(jìn)入二細(xì)胞、囊胚、原腸、神經(jīng)、尾芽、肌效、心搏、出膜期時(shí)，分別取適量受精卵置于裝有Trizol的2 mL離心管中，每個(gè)時(shí)期取5管平行樣，置于-20 ℃冰箱保存.

1.2.2總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成保存于Trizol中的受精卵用破口槍頭吸打數(shù)次，直至胚胎全部破碎，然后置于裝有1 mL Trizol的離心管中.總RNA提取流程參照 Trizol Reagent（Invitrogen）說明書操作.所有總RNA樣品分別取1 μL作為模板，按照One Step PrimeScript miRNA cDNA synthesis Kit試劑盒（寶生物公司，大連）的說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成的cDNA第一鏈，于4 ℃冰箱保存待用.

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量檢測miR146a的表達(dá)根據(jù)Chu等[15]建立的鱖魚miRNA文庫，設(shè)計(jì)miR146a特異性的上游引物，以管家基因βactin作為胚胎發(fā)育階段樣品的內(nèi)參基因[16].用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)熒光定量PCR的引物，引物由上海鉑尚生物公司合成 （見表1）.取2 μL逆轉(zhuǎn)錄好的cDNA為模板，加入12.5 μL SYBR Premix Ex Taq Ⅱ （寶生物公司， 大連），1 μL特異性的上游引物和1 μL通用下游引物（UnimiR qPCR Primer， 10 μmol/L， 寶生物公司）， 8.5 μL的無菌水，總體積25 μL，擴(kuò)增反應(yīng)在BioRad CFX96 system （USA）上進(jìn)行.擴(kuò)增條件為：（1）95 ℃預(yù)變性60 s；（2）擴(kuò)增和定量，95 ℃變性5 s，60 ℃退火和延伸25 s，重復(fù)40個(gè)循環(huán).（3） 繪制融解曲線（65～95 ℃，每0.1 ℃檢測一次熒光值）.

表1熒光定量檢測用引物

Tab.1Primers used for miRNA detection

名稱Name引物序列（5′→3′）miR146aFCGTGAGACTGATTCCATAGATGGβactinFGCCGTGACCTGACTGACTACCTβactinRCGCAAGACTCCATACCCAAGAAG注：miR146a定量所使用的下游引物為通用引物，序列未公布，購自寶生物工程（大連）有限公司（濃度：10 μmol/L）.

1.2.4數(shù)據(jù)處理相對表達(dá)結(jié)果計(jì)算公式為R=2-ΔΔCt，其中Ct值為PCR反應(yīng)循環(huán)閾值，ΔΔCt的計(jì)算公式為：ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）實(shí)驗(yàn)組-（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）對照組.采用SPSS12.0軟件對所得相對表達(dá)豐度數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（Oneway ANOVA），并采用最小顯著差數(shù)法（LSD）進(jìn)行多重比較（P<0.05表示顯著性差異，P<0.01表示差異極顯著），結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（Mean±SE，n=5）表示.

2結(jié)果與分析

2.1miR146a在胚胎發(fā)育性表達(dá)

有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iRNA在不同的細(xì)胞和不同的發(fā)育階段有差異性的表達(dá)，并且它們參與細(xì)胞的生長、分化以及凋亡等過程[1718].目前miRNA在魚類胚胎發(fā)育階段的表達(dá)研究還較少，且暫未有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR146a在魚類胚胎的發(fā)育性表達(dá).圖1結(jié)果顯示，胚胎在22 ℃水溫孵化下，miR146a的表達(dá)在發(fā)育早期處于較高水平，其中原腸期前的各時(shí)期表達(dá)沒有顯著性差異，進(jìn)入尾芽期后顯著性地降低，并持續(xù)降低，在出膜期時(shí)達(dá)到最低水平.而在25 ℃孵化時(shí)，miR146a的表達(dá)在神經(jīng)期前處于較高水平且各時(shí)期都沒有顯著性差異，在尾芽期顯著性地降低，在肌效期達(dá)到最低值，心搏期和出膜期處于較低水平并且之間沒有顯著性差異（圖1）.

圖1miR146a在翹嘴鱖受精卵不同發(fā)育時(shí)期的相對表達(dá)情況.A和B分別為miR146a在22 ℃和25 ℃水溫孵化下不同時(shí)期的發(fā)育性表達(dá).相對表達(dá)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（n=5）.不同的字母代表存在顯著性差異（P<0.05）

Fig.1Detection of miR146a expression at different embryonic developmental stages. A， B represent miR146a expressed at different embryonic developmental stages when incubation under 22 ℃and 25 ℃ water temperature， respectively. Values are the mean ±SE， n=5. The different letters indicate significant differences between columns （P<0.05）2.2miR146a在不同溫度孵化下的差異性表達(dá)

圖1的結(jié)果顯示溫度影響了miRNA在胚胎發(fā)育中的表達(dá).當(dāng)比較胚胎發(fā)育同一時(shí)期在22 ℃和25 ℃水溫孵化下miR146a的表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，miR146a在25 ℃水溫孵化時(shí)的表達(dá)較22 ℃孵化下同時(shí)期的表達(dá)都出現(xiàn)顯著性地降低，其中除出膜期外，其他時(shí)期的表達(dá)差異極顯著（P<0.01）（圖2）.

圖2miR146a在翹嘴鱖受精卵不同水溫孵化下，同一時(shí)期的差異性表達(dá).每個(gè)時(shí)期均以22 ℃孵化下的表達(dá)值作為對照，*代表顯著性差異（P<0.05），**代表差異極顯著（P<0.01）

Fig.2The contrastive expression of miR146a incubated under different water temperature. The data was expressed as the relative change compared with the expression level of each stage incubated under 22 ℃， asterisk （*） indicates significant difference （P<0.05）， double asterisk （**） indicates significance at P<0.013討論

miR146a最初被發(fā)現(xiàn)在miRNA中參與天然免疫應(yīng)答，當(dāng)單核細(xì)胞受到細(xì)菌內(nèi)毒素侵襲時(shí)，miR146a的表達(dá)顯著上調(diào)[19].近年來許多文獻(xiàn)報(bào)道，miR146a調(diào)節(jié)的許多靶基因參與了細(xì)胞分化的作用，但這些研究主要集中在分析miR146a對造血細(xì)胞的分化作用，而miR146a對胚胎發(fā)育的作用暫未見到相關(guān)報(bào)道.Kuang等[10]的研究驗(yàn)證了miR146a能夠抑制Numb的表達(dá).Numb是一種進(jìn)化保守蛋白，其作為內(nèi)源性細(xì)胞命運(yùn)決定因子，對細(xì)胞分裂的命運(yùn)起決定作用.Numb對胚胎早期神經(jīng)和肌肉的發(fā)育作用也已經(jīng)被證明[2021].Numb作為一個(gè)重要的細(xì)胞命運(yùn)決定蛋白，參與Notch的負(fù)性調(diào)控，兩者的平衡決定了細(xì)胞分化的方向[22].Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作為生物發(fā)育分化中高度保守的通路，通過與配體的相互作用產(chǎn)生級聯(lián)瀑布效應(yīng)，參與細(xì)胞發(fā)育過程中分化方向的選擇，并對細(xì)胞的增殖及凋亡也起著重要的作用[2324].Notch信號(hào)通路在胚胎發(fā)育中起到調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和決定細(xì)胞命運(yùn)的作用[25].激活Notch信號(hào)能夠促進(jìn)肌原細(xì)胞的增殖，并降低MyoD和myogenin的表達(dá)來延遲成肌細(xì)胞的分化[26].miR146a及其靶基因的研究為進(jìn)一步了解miR146a在胚胎發(fā)育中潛在的作用提供了一些重要的理論依據(jù).

翹嘴鱖miR146a胚胎發(fā)育性表達(dá)結(jié)果顯示，在22 ℃和25 ℃水溫孵化下，miR146a表達(dá)規(guī)律趨勢總體相似，但在不同溫度下，miR146a的表達(dá)在幾個(gè)時(shí)期經(jīng)歷了微調(diào)，說明溫度確實(shí)影響了miR146a的表達(dá).本文結(jié)果顯示在胚胎發(fā)育早期（二細(xì)胞到神經(jīng)胚期）miR146a的表達(dá)趨于穩(wěn)定且處于較高水平（除22 ℃神經(jīng)胚期有顯著性上升），在進(jìn)入尾芽期后表達(dá)都顯著性地降低.Giraldez等[27]的研究表明miRNA的作用并不是在發(fā)育早期決定細(xì)胞的命運(yùn)而是影響發(fā)育后期組織的發(fā)育和形成，而在神經(jīng)胚期前胚胎的大部分組織器官還未開始分化，本文結(jié)果與Giraldez等的結(jié)論相符.胚胎發(fā)育經(jīng)過神經(jīng)胚期后，是器官形成的主要階段，而本文結(jié)果顯示miR146a的表達(dá)在尾芽期顯著降低，表明miR146a的靶基因在這個(gè)階段后受到其抑制作用將明顯降低，并推測miR146a的靶基因的作用可能是促進(jìn)胚胎發(fā)育的.Kuang等[10]的研究發(fā)現(xiàn)Numb是miR146a的靶基因，Numb能夠促進(jìn)胚胎早期神經(jīng)和肌肉的發(fā)育[2021]，Numb參與調(diào)節(jié)的Notch信號(hào)通路也對胚胎的發(fā)育起到重要的作用.

溫度是影響魚類胚胎發(fā)育的一個(gè)主要的外在因子.大量研究表明，在適宜溫度下，隨著水溫的升高，胚胎的發(fā)育進(jìn)程加快，孵化所需時(shí)間縮短[2829]，但是miRNA的表達(dá)是否受到溫度的影響還未見相關(guān)報(bào)道.從圖2可以看出，在25 ℃孵化時(shí)，miR146a在不同階段的表達(dá)都比22 ℃時(shí)出現(xiàn)顯著性降低.這一結(jié)果表明溫度升高能降低miR146a的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)胚胎的發(fā)育.有研究表明肌纖維增生和增粗的速率在較高的水溫孵化時(shí)都會(huì)升高，但是溫度對肌纖維的增粗效果強(qiáng)于增生[5].在25 ℃孵化時(shí)，miR146a的表達(dá)顯著性降低能增強(qiáng)Numb對Notch信號(hào)通路的抑制作用，促進(jìn)成肌細(xì)胞的分化，從而有利于胚胎中肌肉組織形成.這一結(jié)果表明了miR146a在參與水溫調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育的過程中是通過下調(diào)來促進(jìn)發(fā)育的.

4結(jié)論

研究表明，miR146a在胚胎發(fā)育早期（神經(jīng)期前）的作用不明顯.在胚胎發(fā)育后期（尾芽期至出膜），miR146a通過下調(diào)其表達(dá)來促進(jìn)胚胎的發(fā)育.而水溫升高能顯著降低miR146a在胚胎發(fā)育每個(gè)時(shí)期的表達(dá)，減少其對靶基因Numb的抑制，發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞分化的作用，從而有利于胚胎發(fā)育的進(jìn)程.

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（編輯王?。?